粟倩雅 林彤 周啟艷 彭霖

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所激光科

Wnt5A基因過(guò)表達(dá)對(duì)黑素細(xì)胞骨架蛋白的影響

粟倩雅 林彤 周啟艷 彭霖

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所激光科

目的探討攜帶Wnt5A全基因序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞后，Wnt5A表達(dá)升高對(duì)黑素細(xì)胞骨架蛋白的影響。方法培養(yǎng)原代人表皮黑素細(xì)胞，并分為3組：①空白對(duì)照組：除細(xì)胞外不加任何試劑；②陰性對(duì)照組：加入空白的去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM培養(yǎng)基及Lipo3000；③Wnt5A質(zhì)粒組：加入Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM培養(yǎng)基及Lipo3000。Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞，采用qPCR法檢測(cè)各組Wnt5A、Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Rac1）、絲狀肌動(dòng)蛋白（F肌動(dòng)蛋白）和β微管蛋白基因表達(dá)，Western印跡法測(cè)定Wnt5A、酪氨酸激酶受體2（ROR2）、Rac1、F肌動(dòng)蛋白和β微管蛋白表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)情況。結(jié)果qPCR法顯示，Wnt5A質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)量3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 374.179、112.576、66.458，均P＜0.01），但β微管蛋白mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A、Rac1和F肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（P＜0.05）。Western印跡法顯示，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A蛋白表達(dá)較空白對(duì)照及陰性對(duì)照明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Rac1、ROR2、F肌動(dòng)蛋白表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），但β微管蛋白表達(dá)在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，Wnt5A質(zhì)粒組綠色（β微管蛋白）、紅色（F肌動(dòng)蛋白）熒光強(qiáng)度與兩個(gè)對(duì)照組相比均無(wú)明顯差別，但黑素細(xì)胞體積明顯增大，樹(shù)突數(shù)目明顯增多，細(xì)胞骨架顯著改變，表現(xiàn)為F肌動(dòng)蛋白強(qiáng)弱不一，紋理模糊，張力絲斷裂，局部呈團(tuán)塊狀。結(jié)論黑素細(xì)胞Wnt5A基因表達(dá)升高可調(diào)控細(xì)胞骨架相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，使黑素細(xì)胞體積增大、樹(shù)突增多、骨架改變，可能有利于黑素小體的輸送傳遞，參與色素沉著性疾病的發(fā)病。

黑素細(xì)胞；Wnt信號(hào)通路；細(xì)胞骨架；肌動(dòng)蛋白類(lèi)；微管蛋白；rac1 GTP結(jié)合蛋白質(zhì)；Wnt5A蛋白質(zhì)

在黑素瘤的發(fā)展過(guò)程中非經(jīng)典通路Wnt5A表達(dá)有所增加，且Wnt5A表達(dá)增加與黑素瘤轉(zhuǎn)移有很大關(guān)系［1］。在黃褐斑皮損中，Wnt5A、Wnt抑制因子1（WIF1）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白 2（SFRP2）等多個(gè)Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)也異常增高，其中Wnt5A在皮損黑素細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，提示它在黃褐斑黑素細(xì)胞生物學(xué)改變和黑素生成過(guò)程中起作用［2］。在黃褐斑組織學(xué)上，黑素細(xì)胞功能亢進(jìn)，體積增大，突觸延長(zhǎng)，部分黑素細(xì)胞的樹(shù)突甚至伸入真皮淺層，而黑素細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯增加［3］。我們研究Wnt5A表達(dá)升高對(duì)黑素細(xì)胞骨架蛋白和黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

Medium254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基、HMGS添加劑、分離酶（Protease type IX）、Triton?X100（美國(guó)Sigma公司），Opti?MEM培養(yǎng)基、完全1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），第一鏈cDNA合成試劑盒、脂質(zhì)體3000（Lipo 3000）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），SYBR Green Master Mix（High ROX premixed）（美國(guó) Vazyme 公司），Wnt5A/Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Rac1）/絲狀肌動(dòng)蛋白（F肌動(dòng)蛋白）/酪氨酸激酶受體2（ROR2）小鼠單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），β微管蛋白小鼠單克隆抗體（武漢谷歌生物科技公司），羅丹明標(biāo)記的鬼比環(huán)肽（美國(guó)Cytoskeleton公司），鼠抗人β微管蛋白一抗抗體（美國(guó)Affinity Biosciences公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗抗體（上海翊圣生物科技有限公司），DAPI（美國(guó)Southern Biotech公司），人GAPDH內(nèi)參引物、Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

二、人原代黑素細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取男童包皮環(huán)切術(shù)后多余皮膚，用分散酶作用10～14 h，分離表皮與真皮，加入0.25%胰酶，0.01%乙二胺四乙酸（EDTA）室溫下消化，1640培養(yǎng)基終止消化，棄上清液，用完全黑素培養(yǎng)基混懸。24 h后首次換液，去除未貼壁的細(xì)胞，15～20 d后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)傳代純化培養(yǎng)。取第2～5代黑素細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)前患者家屬或監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

三、Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的構(gòu)建

Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司構(gòu)建，質(zhì)粒的酶切圖譜見(jiàn)圖1。Wnt5A基因序列參見(jiàn)NCBI鏈接地址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001256105.1。

圖1 Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的酶切圖譜

四、qPCR檢測(cè)Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后各基因表達(dá)

將黑素細(xì)胞接種到6孔板上，待細(xì)胞融合70%～90%時(shí)，各孔加入2 ml M254黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組：①空白對(duì)照組：除細(xì)胞外不加任何試劑；②陰性對(duì)照組：加入空白的去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM及Lipo3000；③Wnt5A質(zhì)粒組：加入Wnt5A去內(nèi)毒素pcDNA3.1（+）質(zhì)粒、Opti?MEM及Lipo3000。陰性對(duì)照組及Wnt5A質(zhì)粒組質(zhì)粒濃度均為0.642 g/L（實(shí)際每孔加入質(zhì)粒DNA為1 μg）。轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備如下：用121.25 μl Opti?MEM培養(yǎng)基稀釋 3.75 μl Lipo3000 試劑，充分混勻；用 121.44 μl Opti?MEM培養(yǎng)基稀釋1.56 μl質(zhì)粒DNA，然后添加2 μl P3000試劑，充分混勻。在已稀釋的Lipo3000試劑中加入稀釋的質(zhì)粒DNA，室溫孵育10～15 min。最后將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞孔中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿以混勻。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行qPCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：50℃ 2 min；95℃ 預(yù)變性10 min；95℃變性10 s；60℃退火/延伸40 s；共40個(gè)循環(huán)。采集熒光信號(hào)；自60℃至95.0℃緩慢升溫進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。參照說(shuō)明書(shū)通過(guò)相對(duì)CT法檢測(cè)Wnt5A、Rac1、F肌動(dòng)蛋白和β微管蛋白基因表達(dá)。

五、Western印跡法檢測(cè)Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后各蛋白表達(dá)

將黑素細(xì)胞接種到60 mm培養(yǎng)皿（底面積是6孔板單孔的2.2倍）上，各試劑按相應(yīng)規(guī)模調(diào)整，分組、轉(zhuǎn)染方法同前。培養(yǎng)72 h后，按細(xì)胞全蛋白提取試劑盒方法提取細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品加熱變性后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜，與一抗、二抗孵育，ECL發(fā)光法壓片顯色。用軟件ImageJ或Alpha Ease FC對(duì)所得條帶進(jìn)行灰度分析，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值計(jì)算相對(duì)灰度值，檢測(cè) Wnt5A、ROR2、Rac1、F肌動(dòng)蛋白和β微管蛋白的表達(dá)。

六、通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀(guān)察Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后細(xì)胞骨架及相關(guān)蛋白表達(dá)

提前數(shù)天將細(xì)胞傳代于放置有預(yù)先包被10 μg/cm2纖維連接蛋白蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞融合60%～70%時(shí)，各試劑按相應(yīng)規(guī)模調(diào)整后，分組、轉(zhuǎn)染方法同前。培養(yǎng)72 h后，浸入4%多聚甲醛液中固定細(xì)胞，0.5%TritonX?100室溫下裂解細(xì)胞后，用封閉羊血清覆蓋細(xì)胞。依次滴加100 nmol/L羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽、鼠抗人β微管蛋白一抗溶液（1∶400）、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗溶液（1∶200），各在37℃避光孵育30 min。用DAPI封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞骨架及F肌動(dòng)蛋白、β微管蛋白表達(dá)。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析及SNK檢驗(yàn)分析各組間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、qPCR檢測(cè)Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后各基因的表達(dá)

Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞后，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A mRNA表達(dá)量及其下游基因Rac1和F肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但β微管蛋白基因表達(dá)在3組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

二、Western印跡法檢測(cè)Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后各蛋白表達(dá)量

Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞后，Wnt5A質(zhì)粒組Wnt5A蛋白表達(dá)較空白對(duì)照及陰性對(duì)照明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Wnt5A質(zhì)粒組Rac1、ROR2、F肌動(dòng)蛋白表達(dá)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。β微管蛋白表達(dá)在3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3，圖2。

表1 qPCR擴(kuò)增引物序列

表2 qPCR檢測(cè)各組黑素細(xì)胞Wnt5A基因及其下游基因的相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2 qPCR檢測(cè)各組黑素細(xì)胞Wnt5A基因及其下游基因的相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：n=3。Rac1：Ras相關(guān)C3肉毒素底物1

組別Wnt5A質(zhì)粒組陰性對(duì)照組空白對(duì)照組F值P值Wnt5A 812.694±37.922 1.028±0.238 1.032±0.293 1 374.179＜0.001 Rac1 4.035±0.022 1.977±0.244 1.037±0.357 112.576＜0.001絲狀肌動(dòng)蛋白2601.842±344.025 507.306±372.947 1.267±1.098 66.458 0.002 β微管蛋白0.870±0.218 0.660±0.108 1.013±0.203 2.829 0.208

表3 各組黑素細(xì)胞Wnt5A、ROR2、F?actin、β微管蛋白及Rac1蛋白條帶相對(duì)灰度值（±s）

表3 各組黑素細(xì)胞Wnt5A、ROR2、F?actin、β微管蛋白及Rac1蛋白條帶相對(duì)灰度值（±s）

注：n=3。ROR2：酪氨酸激酶受體2；Rac1：Ras相關(guān)C3肉毒素底物1

組別Wnt5A質(zhì)粒組陰性對(duì)照組空白對(duì)照組F值P值Wnt5A 0.690±0.003 0.153±0.003 0.152±0.003 3 940.029＜0.001 β微管蛋白0.688±0.014 0.687±0.010 0.688±0.010 0.030 0.971絲狀肌動(dòng)蛋白0.423±0.009 0.822±0.011 0.823±0.010 1 918.495＜0.001 Rac1 0.706±0.015 0.883±0.012 0.882±0.113 233.699＜0.001 ROR2 0.707±0.015 0.936±0.119 0.935±0.119 1 287.949＜0.001

三、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀(guān)察Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人原代黑素細(xì)胞后細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)

Wnt5A質(zhì)粒組綠色（β微管蛋白）、紅色（F肌動(dòng)蛋白）熒光強(qiáng)度與兩個(gè)對(duì)照組相比均無(wú)明顯差別，但細(xì)胞體積明顯增大，樹(shù)突數(shù)目明顯增多。仔細(xì)觀(guān)察紅色熒光圖，與兩個(gè)對(duì)照組相比，Wnt5A質(zhì)粒組細(xì)胞骨架有明顯改變，表現(xiàn)為F肌動(dòng)蛋白紋理模糊，張力絲斷裂、強(qiáng)弱不一，局部呈團(tuán)塊狀。見(jiàn)圖3。

討 論

圖2 Western印跡法檢測(cè)Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞后各組Wnt5A、ROR2、Rac1、絲狀肌動(dòng)蛋白、β微管蛋白及Rac1蛋白電泳圖 ROR2：酪氨酸激酶受體2；Rac1：Ras相關(guān)C3肉毒素底物1

Wnt經(jīng)典通路主要由Wnt3A與β聯(lián)蛋白介導(dǎo)，影響細(xì)胞增殖、發(fā)育和組織代謝相關(guān)靶基因表達(dá)及腫瘤的發(fā)生［4］；非經(jīng)典通路通過(guò)Wnt5A、Wnt11等轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞的極性、細(xì)胞間黏附和遷移［5］。Wnt5A可以通過(guò)非經(jīng)典途徑調(diào)控RhoGTP酶，啟動(dòng)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響樹(shù)突形成相關(guān)蛋白。樹(shù)突形成相關(guān)蛋白，包括如Ras相關(guān)的 Rac1（C3肉毒素底物 1）和Cdc4（細(xì)胞周期分裂蛋白4）。樹(shù)突相關(guān)蛋白水平受RhoGTP酶調(diào)控［6］。RhoGTP酶（又稱(chēng)小G蛋白）是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，屬于Ras超家族，有20多種家庭成員，其中較重要的是 RhoA、Rac1 和Cdc42［7］。RhoGTP 酶對(duì)傳遞整合素介導(dǎo)的反應(yīng)非常必要，它可以緊密調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)力，在細(xì)胞的黏附、傳遞和遷移的過(guò)程中提供關(guān)鍵性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8?9］。

在進(jìn)行Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人黑素細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們起初按照Lipofectamine3000試劑推薦的轉(zhuǎn)染規(guī)模（2.5 μg）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)Wnt5A質(zhì)粒組及陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染后6 h基本無(wú)細(xì)胞死亡，24、48、72 h后分別出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加，細(xì)胞死亡數(shù)目增多，至72 h提取蛋白時(shí)死亡細(xì)胞達(dá)60%～70%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們嘗試6 h換液、24 h換液，Wnt5A質(zhì)粒組及陰性對(duì)照組細(xì)胞死亡數(shù)目未見(jiàn)明顯減少，而空白組細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)無(wú)明顯改變，考慮導(dǎo)致細(xì)胞死亡的原因可能是去內(nèi)毒素質(zhì)粒毒性較大，同時(shí)體外培養(yǎng)的原代人黑素細(xì)胞生存力較差，因此，我們改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)條件，將質(zhì)粒的質(zhì)量減小到1.0 μg，以保證轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞狀態(tài)，使目標(biāo)蛋白能夠過(guò)表達(dá)。質(zhì)粒設(shè)計(jì)過(guò)程中，本可以在質(zhì)粒上加熒光標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后可采用熒光顯微鏡觀(guān)察，流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，但考慮到質(zhì)粒本身的熒光顏色可能干擾后期實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)蛋白的觀(guān)察，因此，沒(méi)有在質(zhì)粒上加入熒光標(biāo)記。

圖3 Wnt5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代黑素細(xì)胞后免疫熒光染色（激光共聚焦顯微鏡×60） 綠色熒光標(biāo)記β微管蛋白；紅色熒光標(biāo)記絲狀肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核。Wnt5A質(zhì)粒組細(xì)胞骨架有明顯改變，表現(xiàn)為絲狀肌動(dòng)蛋白紋理模糊，張力絲斷裂，強(qiáng)弱不一、局部呈團(tuán)塊狀

本研究結(jié)果顯示，Wnt5A過(guò)表達(dá)后，Rac1和F肌動(dòng)蛋白基因均出現(xiàn)表達(dá)升高，但Rac1、F肌動(dòng)蛋白和ROR2蛋白表達(dá)降低，β微管蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。我們推測(cè)Wnt5A可能通過(guò)Ca2+途徑或平面細(xì)胞極性（PCP）途徑，激活下游RhoGTP酶Rac1，使Rac1基因表達(dá)增加。Rac1基因參與下游通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活F肌動(dòng)蛋白基因，因此被消耗，使得Rac1蛋白表達(dá)減少。細(xì)胞骨架由微絲、中間絲和微管及相關(guān)的骨架蛋白組成［10］，其中微絲主要由3類(lèi)蛋白質(zhì)組成：肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。肌動(dòng)蛋白有球狀單體（G肌動(dòng)蛋白）和絲狀聚合體（即F肌動(dòng)蛋白）兩種形式，F(xiàn)肌動(dòng)蛋白為雙螺旋狀微絲，G肌動(dòng)蛋白不斷地加入或脫落，使F肌動(dòng)蛋白保持著聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞骨架的形態(tài)和功能［11］。F肌動(dòng)蛋白減少可能是由于解聚增加，細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白發(fā)生重排；另一種可能是F肌動(dòng)蛋白翻譯成蛋白較轉(zhuǎn)錄為mRNA晚，因此F肌動(dòng)蛋白未在培養(yǎng)72 h時(shí)出現(xiàn)蛋白明顯升高，可能是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短。β微管蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯改變，但免疫熒光染色顯示熒光強(qiáng)度減弱，提示β微管蛋白在量上沒(méi)有改變，而是細(xì)胞的微管系統(tǒng)重新排列，促進(jìn)樹(shù)突向外生長(zhǎng)［12］，與F肌動(dòng)蛋白共同使細(xì)胞胞體變大、樹(shù)突變長(zhǎng)。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，Wnt5A過(guò)表達(dá)的黑素細(xì)胞體積增大，樹(shù)突增多，骨架重排。黑素細(xì)胞位于表皮基底層，必須通過(guò)增加樹(shù)突的數(shù)量和長(zhǎng)度才能更有效地實(shí)現(xiàn)向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素。黑素細(xì)胞樹(shù)突的重要功能就是為黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞的輸送和轉(zhuǎn)運(yùn)提供一個(gè)管狀結(jié)構(gòu)［13］。我們推測(cè)，Wnt5A表達(dá)增加后，通過(guò)活化Rac1（表現(xiàn)為F肌動(dòng)蛋白解聚增加，紋理模糊、不連續(xù)，局部呈團(tuán)塊狀）影響細(xì)胞樹(shù)突，誘導(dǎo)黑素細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的重排，使胞體增大和樹(shù)突增多等。我們推測(cè)，胞體增大、樹(shù)突增多、骨架重排這一系列變化可共同促進(jìn)黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素小體，促進(jìn)色素沉著。

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Effects of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteinsof melanocytes

Su Qianya,Lin Tong,Zhou Qiyan,Peng Lin
Laser Department,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Lin Tong,Email:ddlin@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of Wnt5A gene overexpression on cytoskeletal proteins of melanocytes after the plasmid containing the Wnt5A gene is transfected into primary melanocytes.MethodsIn vitrocultured primary human melanocytes were divided into three groups:blank control group receiving no treatment,negative control group transfected with endotoxin?free pcDNA3.1（+）empty vector by Lipo3000 in Opti?MEM medium,Wnt5A plasmid group transfected with endotoxin?free pcDNA3.1（+）vector containing the Wnt5A gene by Lipo3000 in Opti?MEM medium.After the trans?fection,quantitative PCR（qPCR）was performed to measure the mRNA expression of Wnt5A,ras?related C3 botulinum toxin substrate 1（Rac1）,filamentous actin（F?actin）and β?tubulin,Western blot analysis to determine the protein expression of Wnt5A,receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2（ROR2）,Rac1,F?actin and β?tubulin,and an immunofluorescence assay（IFA）to observe the expression of cytoskeletal proteins.ResultsqPCR showed significant differences in the mRNA expression of the Wnt5A gene and its downstream genes Rac1 and F?actin among the Wnt5A plasmid group,negative control group and blank control group（F=1 374.179,112.576,66.458,respectively,allP＜ 0.01）,but there was no significant difference in the mRNA expression of β?tubulin among the three groups（P＞ 0.05）.Additionally,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher mRNA expression of Wnt5A,Rac1 and F?actin compared with the blank control group and negative control group（allP＜ 0.05）.As Western blot analysis revealed,compared with the blank control group and negative control group,the Wnt5A plasmid group showed significantly higher Wnt5A protein expression（bothP＜ 0.05）,but significantly lower protein expression of Rac1,ROR2 and F?actin（allP＜ 0.05）.However,no significant difference in β?tubulin protein expression was observed among the three groups（P＞ 0.05）.IFA showed no obvious difference in the fluorescence intensity of β?tubulin or F?actin between the Wnt5A group and the two control groups,but melanocytes showed larger size and increased number of dendrites,and the cytoskeleton changed dramatically with varying fluorescence intensity of F?actin,fuzzy texture,fractured or locally clustered tonofilaments in the Wnt5A group.ConclusionThe overexpression of the Wnt5A gene in melanocytes can regulate the mRNA and protein expression of cytoskeletal proteins,make melanocytes larger and more dendritic,and cause changes in the cytoskeleton,which may facilitate the transportation of melanosomes,and participate in the occurrence of hyperpigmented diseases.

Melanocytes;Wnt signaling pathway;Cytoskeleton;Actins;Tubulin;rac1 GTP?binding protein;Wnt5A protein

林彤，Email：ddlin@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.009

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012507）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012507）

2016?08?01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）