蘇惠春 羅陽 劉笑純 韓悅 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病醫(yī)院過敏及風濕免疫科［蘇惠春（現(xiàn)在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，350004福州）、羅陽、韓悅、劉笑純、溫禾、姚煦］；中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3與樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子體外結(jié)合能力研究

蘇惠春 羅陽 劉笑純 韓悅 溫禾 姚煦 王寶璽

210042南京，中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病醫(yī)院過敏及風濕免疫科［蘇惠春（現(xiàn)在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，350004福州）、羅陽、韓悅、劉笑純、溫禾、姚煦］；中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

目的檢測樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子（DC?SIGN）轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞和單核細胞來源的樹突細胞（MDDC）膜表面DC?SIGN受體對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3（TG3）的識別和攝取能力。方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將融合有DC?SIGN基因片段及真核表達載體pGCMV?EGFP（增強綠色熒光蛋白）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，制備DC?SIGN?EGFP?HEK293T細胞；通過磁珠陰性分選出外周血中CD14+單核細胞，并通過粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素4誘導獲得MDDC。利用激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞及MDDC上DC?SIGN受體對TG3蛋白的識別和攝取，并設立空白對照組（不加入Alexa Fluor?647染料標記的TG3）和陰性對照組（僅加入Alexa Fluor?647染料）。結(jié)果TG3與HEK293T和MDDC細胞孵育3 h后，激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀均顯示，TG3可以被HEK293T及MDDC細胞上DC?SIGN受體識別并結(jié)合攝取入細胞內(nèi)，流式細胞儀檢測顯示TG3與MDDC的結(jié)合可被DC?SIGN阻斷抗體部分阻斷。陰性對照組和空白對照組未見HEK393T或MDDC細胞對TG3的識別和結(jié)合。結(jié)論TG3可以作為一種自身抗原被DC?SIGN受體識別、結(jié)合，并被介導攝取進入樹突細胞。

樹突細胞；自身抗原；外源凝集素類，C型；受體，模式識別；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3；樹突細胞特異性非整合素黏附分子

自身變態(tài)反應在特應性皮炎（AD）中的致病作用已經(jīng)被證實。目前已發(fā)現(xiàn)多種自身抗原如rhMnSOD、Homs1?5、抗β2糖蛋白等可以引起機體產(chǎn)生特異性IgE（sIgE），部分抗原sIgE表達水平還與患者病情嚴重程度密切相關(guān)［1?2］。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminases，TG）是一種鈣離子依賴性蛋白酶，其中TG3是一種重要的TG，它主要存在于表皮和毛囊的角質(zhì)形成細胞中，參與角質(zhì)形成細胞分化，同時也是絲聚蛋白連接肽片段的底物，參與維護表皮屏障［3?4］。與健康對照和AD患者的非皮損區(qū)比較，AD患者皮損區(qū)TG3蛋白表達明顯升高［5］，提示TG3參與AD發(fā)病，但具體機制尚不明確。我們前期研究顯示，作為一種重要的C型凝集素受體，樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子（DC?SIGN）可特異性識別糖基結(jié)構(gòu)，從而介導樹突細胞（DC）活化和炎癥反應［6］。由于TG3作為一種蛋白酶，應該含有一定的糖基，我們推測TG3可能通過DC?SIGN受體被DC識別和攝取，從而介導下游免疫反應，為此我們進行DC?SIGN受體對TG3的識別和攝取研究。

材料與方法

一、材料

TG3、重組人粒細胞?巨噬細胞集落刺激因子（rh?GM?CSF）、重組人白細胞介素4（RhIL?4）和重組人DC?SIGN（RhDC?SIGN）/Fc嵌合體（美國R&D公司），HEK293T細胞株［美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）］，表達DC?SIGN熒光融合蛋白的真核表達載體-大腸桿菌、Alexa Fluor?488熒光染料、Alexa Fluor?647熒光染料（美國life公司），質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA回收試劑（日本TaKaRa公司），不完全RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），脂質(zhì)體 Lipofectamin 2000（美國Invitrogen公司），小鼠抗人DC?SIGN（美國Abcam公司），人淋巴細胞分離液（挪威Axis?shield公司），流式細胞儀檢測抗體DC?SIGN?FITC及同型對照抗體、CD14+單核細胞磁珠分選試劑盒、DC?SIGN流式抗體及同型對照和Mitenyi磁珠分選柱（德國Mitenyi公司），BCA蛋白定量試劑盒、FITC標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。自配LB培養(yǎng)基（每升含胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，雙蒸水950 ml）和完全RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（每500 ml含胎牛血清50 ml、青霉素5萬U、鏈霉素5萬U）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。BD Verse流式分析儀（美國BD公司），Olympus激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

二、方法

1.提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HEK293T細胞：將成功構(gòu)建的融合有DC?SIGN基因片段及真核表達載體pGCMV?EGFP（增強綠色熒光蛋白）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，振蕩培養(yǎng)12 h；提取DH5α大腸桿菌質(zhì)粒DNA，測定DNA濃度和純度；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將融合有DC?SIGN基因片段及pGCMV?EGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，培養(yǎng)48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，對照組轉(zhuǎn)染pEGFP?cl空載體，在細胞表面或細胞內(nèi)見到綠色熒光則表示轉(zhuǎn)染成功。

2.檢測HEK293T細胞上DC?SIGN?EGFP融合蛋白對TG3的識別和攝?。喊凑f明書用染料熒光Alexa Fluor?647標記TG3，濃度為0.75 mg/L。收獲轉(zhuǎn)染48 h的HEK293T細胞；將標記的TG3用不完全1640培養(yǎng)基稀釋為20 mg/L，分2組加入轉(zhuǎn)染后的293T細胞，37℃5%CO2孵箱中分別孵育30 min和3 h，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛避光固定25 min，PBS洗滌3次；加入4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色劑避光孵育10 min；用激光共聚焦顯微鏡檢測融合熒光蛋白、TG3Alex647及DAPI熒光的表達情況。

3.檢測HEK293T細胞上DC?SIGN受體與TG3的結(jié)合：收獲轉(zhuǎn)染48 h的HEK293T細胞，分成6組，即空白對照組，陰性對照組，共孵育（HEK293T細胞與TG3共孵育）30 min、3 h、6 h組，封閉抗體組（加入封閉抗體后HEK293T細胞與TG3共孵育3 h），每組含有1×105個細胞。封閉抗體組提前30 min加入DC?SIGN封閉抗體，30 min后向共孵育組和封閉抗體組中加入標記后的TG3（濃度20 mg/L），在37℃、5%CO2孵箱中分別避光孵育30 min、3 h、6 h，封閉抗體組孵育3 h。同時設立陰性對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK293T細胞）及空白對照組（不加TG3孵育）。孵育后細胞用PBS洗滌，流式細胞儀檢測293T細胞上EGFP標記的DC?SIGN與Alex647標記的TG3的熒光，并分析結(jié)果。

4.分離誘導外周血CD14+單核細胞產(chǎn)生單核細胞來源的樹突細胞（MDDC）并表達DC?SIGN受體：取健康志愿者外周血30 ml（均簽署知情同意書），按說明書收集單核細胞后，用PBS洗滌2次；每107個單核細胞重懸于180 μl PBS中，與20 μl抗人CD14+磁珠混合，4℃避光孵育15 min；離心洗滌后加入1 ml PBS重懸細胞；用磁柱陰性分選出CD14+細胞后計數(shù)；每106個CD14+細胞加入2 ml完全RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第0、2、4天重復加入100 μg/L GM?CSF和20 μg/L IL?4，培養(yǎng)6 d后用抗體DC?SIGN?FITC 4℃避光染色15 min，流式細胞儀檢測MDDC上DC?SIGN的表達，并用FLuoJo X10軟件分析DC?SIGN的表達比例。實驗重復4次取均值。

5.觀察MDDC上DC?SIGN受體對TG3的識別攝?。号囵B(yǎng)6 d后收集MDDC，分為4組，即空白對照組、陰性對照組、共孵育（加入TG3）30 min、3 h組，每組（管）1×105細胞。300×g離心5 min后向共孵育組中加入1 g/L抗DC?SIGN 一抗2 μl，4℃孵育過夜；次日PBS洗滌3次后加入Alex488染料標記的羊抗兔抗DC?SIGN二抗，37℃避光孵育45 min，PBS洗滌2次，將Alex647標記的TG3（20 mg/L）加入MDDC中，在37℃、CO2孵箱中分別孵育30 min、3 h。同時設立空白對照組和陰性對照組，其他處理同上，但是空白對照組不加Alex染料標記的TG3，陰性對照組僅加入Alex647熒光染料。按方法2中固定及DAPI染色的方法操作，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光素標記的TG3與MDDC表面DC?SIGN受體的結(jié)合。

6.檢測MDDC上DC?SIGN受體與TG3的結(jié)合：將高表達DC?SIGN受體的MDDC用PBS離心洗滌；每 105個細胞加入 100 μl PBS 及 10 μl DC?SIGN?FITC抗體和FITC-同型抗體4℃孵育15 min后離心洗滌；將 Alex647標記的 TG3（20 mg/L）加入到MDDC懸液中，37℃CO2孵箱中分別孵育30 min和3 h，并設立空白對照、陰性對照組和DC?SIGN封閉抗體組（抗原刺激前與封閉抗體預孵育3 h），孵育后用PBS洗滌離心2次，獲得的細胞加入500 μl PBS；流式細胞儀檢測MDDC表達的DC?SIGN?FITC與Alex647標記的TG3的結(jié)合，F(xiàn)lowJo X10軟件分析結(jié)果，獲得Alex647?TG3陽性的細胞比例。實驗重復4次取均值。

結(jié) 果

一、重組DC?SIGN?EGFP融合蛋白的表達

激光共聚焦顯微鏡檢測示，真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，DC?SIGN?EGFP重組質(zhì)?？梢栽贖EK293T細胞中表達有綠色熒光。見圖1。

二、HEK293T細胞上DC?SIGN可識別并結(jié)合TG3

激光共聚焦顯微鏡下，空白及陰性對照組HEK293T細胞表面未見紅色熒光（圖2A～2H）；轉(zhuǎn)染DC?SIGN質(zhì)粒后與TG3共孵育30 min時，DC?SIGN?EGFP（綠色熒光）與TG3（紅色熒光）的共定位較少（圖2I～2L）；共孵育3 h后部分293T細胞上DC?SIGN?EGFP受體與TG3出現(xiàn)明顯共定位（圖2M～2P）。

流式細胞儀檢測顯示，結(jié)合TG3的DC?SIGN陽性HEK293T細胞比例隨時間延長而逐漸提高，0.5 h后比例為28.4%，3 h和6 h后比例上升至50.1%和67.1%；加入DC?SIGN封閉抗體后3 h時比例下降至21.5%，陰性及空白對照組未見有結(jié)合TG3的DC?SIGN陽性細胞。

三、MDDC表達的DC?SIGN可以結(jié)合并攝取TG3

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子（DC?SIGN）?EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK 293T細胞（×400） 1A：藍色熒光代表DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚）染的細胞核；1B：綠色熒光代表EGFP（增強綠色熒光蛋白）；1C：綠色和藍色熒光的融合

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察HEK293T細胞上樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子（DC?SIGN）受體與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3（TG3）的結(jié)合（×1 200） 紅色熒光示Alex647標記的TG3，綠色熒光示293T細胞膜上DC?SIGN?EGFP，藍色熒光示DAPI標記的細胞核

激光共聚焦顯微鏡顯示，TG3與MDDC共孵育30 min時，MDDC上DC?SIGN二抗可以與TG3共定位（圖3E～3H），共孵育3 h后TG3不僅可以與MDDC上DC?SIGN結(jié)合，還可以被MDDC攝取入細胞內(nèi)（圖3I～3L），空白對照組及陰性對照組未見有紅色熒光與綠色熒光的融合現(xiàn)象及紅色熒光進入細胞內(nèi)的現(xiàn)象。

流式細胞儀檢測示，外周血單核細胞誘導的MDDC可以表達DC?SIGN受體，表達比例為86%。與TG3共孵育30 min后，DC?SIGN陽性MDDC細胞中，93.7%的細胞TG3染色陽性，DC?SIGN封閉抗體阻斷后結(jié)合比例降至53.7%；共孵育3 h時，96.3%的細胞顯示TG3與DC?SIGN結(jié)合，抗體封閉后結(jié)合比例降至84.6%。

討 論

本研究中，我們首先構(gòu)建轉(zhuǎn)染DC?SIGN的293T細胞，通過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀證實，表達在293T細胞表面的DC?SIGN受體可以有效結(jié)合并介導攝取TG3抗原。由于此模型容易構(gòu)建，故可作為前期篩選研究模型。但由于轉(zhuǎn)染效率較低，并且不能完全模擬DC細胞上DC?SIGN受體的功能，故我們進一步分選外周血單核細胞，采用體外誘導技術(shù)誘導生成MDDC。誘導成功后，流式細胞儀檢測DC?SIGN受體的表達率可高達90%。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，隨著共孵育時間的延長，DC?SIGN受體對TG3抗原的識別和介導內(nèi)吞能力逐漸增強，并且可被DC?SIGN阻斷抗體部分阻斷，提示DC細胞表面的DC?SIGN受體可以識別TG3抗原，并介導內(nèi)吞。TG3的糖基結(jié)構(gòu)尚不明確，我們的TG3為動物來源的蛋白，故推測其帶有一定的糖基結(jié)構(gòu)，后期我們將通過脫糖實驗進一步明確TG3的糖基成分。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，TG3除了與MDDC上DC?SIGN結(jié)合外，還可以通過別的方式被攝取入細胞內(nèi)。這是因為DC表面還表達其他多種模式識別受體，如Toll樣受體和核苷酸結(jié)合寡聚化蛋白受體（nucleotide?binding oligomerization domain proteins，NOD）或其他C型凝集素受體如DEC205、MMR、Clec9A、Clec12A［7］。這些受體可能也具有將TG3進一步攝入細胞內(nèi)的功能。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測單核細胞來源的樹突細胞（MDDC）上的樹突細胞特異性捕獲非整合素的細胞間黏附分子（DC?SIGN）受體與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3（TG3）的結(jié)合（×1 200） 圖中藍色熒光示細胞核，綠色熒光示DC?SIGN二抗，紅色熒光示Alex647標記的TG3

DC?SIGN是一種重要的C型凝集素受體，可以識別含有甘露糖和巖藻糖等配體的病原體或抗原。DC?SIGN的胞外區(qū)糖識別域由28個重復序列組成，可以調(diào)節(jié)分子的多聚化。由于目前市售的DC?SIGN阻斷抗體僅阻斷3個糖識別域的表位，故無法達到理想的阻斷效果，它們更多的是誘導分子產(chǎn)生交叉反應［8］。本研究顯示，DC?SIGN阻斷抗體僅能部分阻斷TG3與DC?SIGN間的結(jié)合。后期我們將通過siRNA方法干擾DC?SIGN上所有7個功能表位來阻斷DC?SIGN受體表達，進一步驗證DC?SIGN與TG3的結(jié)合情況。

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In vitrobinding ability of transglutaminase 3 to dendritic cell?specific intercellular adhesion molecule 3?grabbing nonintegrin

Su Huichun,Luo Yang,Liu Xiaochun,Han Yue,Wen He,Yao Xu,Wang Baoxi
Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Su HC［current affiliation:Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China］,Luo Y,Han Y,Liu XC,Wen H,Yao X）;Department of Dermatology,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China（Wang BX）

s:Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo evaluate the recognition and uptake of transglutaminase 3（TG3）by dendritic cell?specific intercellular adhesion molecule 3?grabbing nonintegrin（DC?SIGN）receptors on the membrane surface of DC?SIGN?transfected human embryonic kidney（HEK）293T cells and monocyte?derived dendritic cells（MDDCs）.MethodsThe eukaryotic expression vector pGCMV?enhanced green fluorescent protein（EGFP）containing DC?SIGN gene fragments was transfected into HEK293T cells to prepare DC?SIGN?EGFP?HEK293T cells by using liposome transfection method.CD14+monocytes were isolated from peripheral blood samples by magnetic bead?based negative selection,and then were induced by granulocyte?macrophage colony stimulating factor（GM?CSF）and interleukin?4（IL?4）to prepare MDDCs.Laser confocal microscopy and flow cytometry were performed to evaluate the recognition and uptake of TG3 protein by DC?SIGN receptors on the surface of HEK293T cells and MDDCs.MDDCs treated without Alexa Fluor 647 dye?tagged TG3 served as blank control group,and those treated with Alexa Fluor 647 dye alone served as negative control group.ResultsAfter co?culture with TG3 for 3 hours,laser confocal microscopy and flow cytometry both showed that TG3 could be recognized by and uptaken through DC?SIGN receptors into HEK293T cells and MDDCs.Flow cytometry also revealed that the binding of TG3 to MDDCs could be partially blocked by DC?SIGN blocking antibodies.Neither the negative control group nor the blank control group showed the recognition and binding of TG3 to HEK293T cells and MDDCs.ConclusionTG3 can serve as a kind of autoantigen to be recognized and bound by DC?SIGN receptors,followed by uptake by dendritic cells.

Dendritic cells;Autoantigens;Lectins,C ?type;Receptors,pattern recognition;Transglutaminase 3;DC?SIGN

姚煦，Email：dryao_xu@126.com；王寶璽，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.08.008

國家自然科學基金（81371735、81573045）；2014年亞美醫(yī)學基金會（MMAAP）皮膚病項目基金；江蘇省自然科學基金（BK20150166）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371735,81573045）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20151066）

2016?11?28）

（本文編輯：尚淑賢）