崔嘉琴， 柏友萍， 蘇 敏， 宋威巍， 林 潺， 吳 琳， 張皓月

(安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 蕪湖 241003)

不同強度運動結(jié)合白藜蘆醇對老年肥胖大鼠RBP4的影響*

崔嘉琴， 柏友萍△， 蘇 敏， 宋威巍， 林 潺， 吳 琳， 張皓月

(安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 蕪湖 241003)

目的探討不同強度運動結(jié)合白藜蘆醇對老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)mRNA蛋白表達(dá)及血漿RBP4濃度的影響。方法選擇鼠齡3周的雄性SD大鼠80只，隨機分為對照組和實驗組：對照組(C)飼喂6.0%脂肪的普通飼料(n=12)；實驗組分3個階段飼喂36%～40%高脂飼料(n=68)。建立老年肥胖大鼠模型，選取24只建模成功的肥胖大鼠隨機分為4組(n=6)：肥胖對照組(CO)、白藜蘆醇組(RO)、低強度運動+白藜蘆醇組(LRO)、中強度運動+白藜蘆醇組(MRO)。LRO組和MRO組的運動強度分別為(12 m/min×15 min)和(15 m/min×15 min)，每天運動60 min；補充白藜蘆醇各組52.5 mg/kg·d灌胃1次，對照組采用等量的純凈水灌胃，持續(xù)干預(yù)8周。8周后采血和腎周、睪周、血管及內(nèi)臟脂肪組織，檢測血糖和血漿RBP4濃度、計算胰島素敏感性(ISI)，檢測RBP4 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠RBP4 mRNA和蛋白表達(dá)、血漿濃度及血糖指標(biāo)明顯升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，RO、LRO組和MRO組大鼠RBP4 mRNA和蛋白表達(dá)、血漿濃度及血糖指標(biāo)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，ISI明顯升高(P<0.05)；RO、LRO組和MRO組之間比較，MRO組大鼠RBP4 mRNA和蛋白表達(dá)、血漿濃度及血糖指標(biāo)明顯降低，ISI明顯升高，但無顯著差異。結(jié)論不同強度運動結(jié)合白藜蘆醇能降低老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織RBP4 mRNA和蛋白表達(dá)及血漿RBP4濃度，受運動強度影響較小。

運動強度；白藜蘆醇；老年肥胖；RBP4

隨著人口老齡化，老年肥胖率呈逐年上升趨勢，老年患者已是慢性代謝性疾病和心血管疾病的高發(fā)人群。肥胖可以引起胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，導(dǎo)致血糖和血脂代謝紊亂，是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的獨立危險因素[1]。T2DM是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第三大非傳染性慢性疾病，其關(guān)鍵因素是胰島素敏感性(insulin sensitivity，ISI)的降低[2]。視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)是一種能夠誘導(dǎo)IR的多功能脂肪因子，其水平升高可以引起胰島素信號傳導(dǎo)功能異常，是肥胖、T2DM、代謝綜合癥等IR相關(guān)疾病的主要發(fā)病機制之一[1]。

運動可以增加機體能量消耗，促使脂肪氧化分解，提高骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運和利用葡萄糖的能力，促進(jìn)ISI的提高，降低血糖[3]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然存在的非黃酮類多酚化合物，具有多重生物活性，其可改善IR、高血糖和脂代謝紊亂[4]。本研究前期發(fā)現(xiàn)[5]通過不同強度運動對青春期肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪組織RBP4 mRNA、肝臟組織蛋白表達(dá)和血漿濃度能起到降低效果，且提高ISI及降低血糖。但不同強度運動結(jié)合Res對老年肥胖大鼠RBP4的影響目前尚不清楚，RBP4在老年肥胖過程中起到怎樣的生理作用至今研究仍較少。本實驗通過高脂飼料誘導(dǎo)建立老年肥胖SD大鼠模型，采用低和中強度運動結(jié)合Res的綜合實施于受試鼠，對受試鼠內(nèi)臟脂肪組織RBP4的轉(zhuǎn)錄與翻譯及血漿濃度進(jìn)行比較分析，為完善運動結(jié)合Res對老年肥胖大鼠RBP4的生理機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器：全自動生化分析儀(日立7060)，酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(Tecan Columbus Washer/瑞士)；6跑道大鼠跑臺(Wi32812/北京)。臺式高速離心機(eppendorf，Centrifuge5417)，PCR儀(MJ research，PTC200)，實時熒光定量PCR儀(博日，line-gene K FQD-48A)。高速冷凍離心機(力康生科，Neofuge15R)，可見紫外分光光度計(日立，U-2001)，凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技，JD801)。

試劑：M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，M1705)，Trizol(SunShineBioTM，SN114)；6×SDS protein Loading buffer(還原型，SunShineBioTM，SN336)，PVDF膜(Millipore)，兔抗RBP4抗體(Bioss，bs-6182R)，羊抗兔IgG-HRP(H+L)(SunShineBioTM，SN134)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(SunShineBioTM，SN135)，大鼠抗β-actin抗體(Boster，BM0627)，PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas，SM0671)。血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。 美國TSZ公司生產(chǎn)的大鼠血漿胰島素和RBP4 ELISA試劑盒(上海研域生物科技有限公司代理)。

1.2 老年肥胖大鼠建模與分組

本實驗對象選擇清潔級雄性SD大鼠80只，鼠齡3周，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[許可證號：SCXK (滬) 2012-0002，合格證號：2007000546402]。幼鼠體重(74.12±7.39)g，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，隨機分為對照組和實驗組，體重?zé)o差異。對照組12只，飼養(yǎng)普通飼料(M01-F-)(能量營養(yǎng)素比例：碳水化合物67.6%，脂肪6.0%，蛋白質(zhì)26.4%)；實驗組68只，分3個階段飼喂高脂飼料，即：第1階段(第4～10周)飼喂36%脂肪供能高脂飼料(M04-F-)(能量營養(yǎng)素比例：碳水化合物45.0%，脂肪36.3%，蛋白質(zhì)18.7%)，第2階段(第31～32周)和第3階段(第56～60周)喂40%脂肪供能高脂飼料(PSY1102-)(能量營養(yǎng)素比例：碳水化合物40.0%，脂肪40.0%，蛋白質(zhì)20.0%)，其他時間段均喂普通飼料。這三個階段喂高脂飼料進(jìn)行催肥，主要是考慮人在生命過程中經(jīng)歷的生長發(fā)育期、壯年期和老年期3個發(fā)展時期[6]。

根據(jù)老年大鼠肥胖成功標(biāo)準(zhǔn)(60周齡，肥胖組體重>對照組體重120%[7])，在建模成功中選取24只肥胖大鼠，隨機分為4組：肥胖對照組(control obese group，CO)、補充白藜蘆醇組(resveratrol obese group，RO)、低強度運動+白藜蘆醇組(low intensity exercise combined with resveratrol obese group，LRO)、中強度運動+白藜蘆醇組(moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group，MRO)，選擇自然生長老年大鼠為空白對照(control group，C)。干預(yù)期間，大鼠分籠飼養(yǎng)(3只/籠)，各組均喂普通飼料，飼料每天定量供給，30 g/d，自由飲水，飼養(yǎng)房的溫度為(20℃±2℃)，相對濕度(50%-70%)，每天光照為12 h，每周測量1次體重。該項研究獲得安徽師范大學(xué)動物倫理學(xué)會的同意(20130225)。實驗中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》[8]。

1.3 運動結(jié)合實驗的設(shè)計與實施

本次運動方案以Bejma等[9]和本實驗室前期的動物運動方案[5]為依據(jù)進(jìn)行改進(jìn)，跑臺坡度為0°。老年大鼠開始進(jìn)行2～3次/天的適應(yīng)性跑臺練習(xí)，訓(xùn)練5 d。運動強度的設(shè)計為低和中，低強度運動為12 m/min×15 min(負(fù)荷強度相當(dāng)于50%～60% VO2max[9])，中強度運動為15 m/min×15 min(負(fù)荷強度相當(dāng)于65%～75% VO2max[9])，4組/次，組間休息5 min，60 min/d。Res方案采用52.5 mg/kg·d灌胃(Res純度為99%，購于中國陜西天行健生物工程股份有限公司)，對照組采用同等劑量的純凈水。每日運動后休息1 h補充Res 1次，5次/周，周二、周五休息，持續(xù)干預(yù)8周。

1.4 樣本采集與保存

8周干預(yù)后，對實驗大鼠禁食12 h，禁水6 h。用10%水合氯醛溶液，劑量為1.22 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后剖腹取腹主動脈血，分離血漿，部分采用全自動生化儀測定血糖，部分保存在-80℃冰箱待ELISA測血RBP4濃度。采集腎周和睪周脂肪組織。取部分含血管少的脂肪立即置于Trizol中，保存在-80℃冰箱，用qRT-PCR測RBP4 mRNA表達(dá)。取部分內(nèi)臟脂肪組織用鋁箔紙包好保存在-80℃冰箱，用Western blot測RBP4蛋白表達(dá)。

1.5 qRT-PCR檢測脂肪組織中RBP4 mRNA表達(dá)

根據(jù)GenBank SD大鼠RBP4基因外顯子序列設(shè)計引物，委托上海生工技術(shù)有限公司合成。RBP4引物：F：5’-CACAGAAGATCCTGCCAAGTTCA-3’，R：5’-CAGAGCGAAGGTGTCGTAGTC-3’；β-actin引物：F：5’-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3’，R：5’-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC -3’。

利用 Trizol 提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴增：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s→60℃退火60 s→60℃延伸60 s，40次循環(huán)；72℃末段延伸5 min；熔解曲線：溫度60℃～95℃，溫度間隔0.3℃，時間5 s/count，RBP4 Tm值為83℃。檢測：臺階。按照上述實驗方法得出數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由軟件自動得出。采用2-△Ct法來進(jìn)行相對定量，

△Ct=Ct(目的基因)- Ct(β-actin)。

1.6Westernblot法檢測內(nèi)臟脂肪組織RBP4蛋白表達(dá)

先在5%濃縮膠中以80 V電泳至分離膠，后在10%分離膠中以120 V繼續(xù)電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將凝膠上的電泳蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，250 mA轉(zhuǎn)移 1.5 h后，將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。接著加入內(nèi)參一抗1∶1 000 稀釋、兔抗1∶500稀釋、4℃孵育過夜，TBST洗膜后，同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液(1∶2 000)并與膜接觸，室溫下孵育1 h。TBST洗膜后，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描，采用凝膠成像系統(tǒng)和Image J2軟件分析目的條帶凈光密度值，以β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析。

1.7 ELISA檢測血漿胰島素和RBP4濃度

血漿胰島素和RBP4濃度采用ELISA的雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠RBP4水平。ELISA操作方法嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書提供的程序進(jìn)行。RBP4濃度值及胰島素濃度值：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。RBP4曲線方程為y=0.046x+0.020，標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999；胰島素曲線方程為y=0.020x+0.008，標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999，把該方程代入Excel工作表中，得到相應(yīng)的濃度值，此濃度值再乘以5為樣本實際濃度。ISI利用定量評價指標(biāo)QUICKI(quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)指數(shù)評定，根據(jù)公式QUICKI = 1/[log(I0)+log(G0)]計算，I0代表空腹胰島素含量(mU/L)，G0代表空腹血糖濃度(mmol/L)[10]。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.18周干預(yù)后內(nèi)臟脂肪組織RBP4mRNA表達(dá)和血漿RBP4濃度比較

RBP4 mRNA表達(dá)CO組明顯高于C組，差異顯著(P<0.05)。RO、LRO及MRO三組均明顯低于CO組，差異顯著(P<0.05，P<0.01)，其中RO組和MRO組低于LRO組，MRO組低于RO組，但差異不顯著。血漿RBP4濃度CO組明顯高于C組，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。RO、LRO及MRO三組均明顯低于CO組，且有非常顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，其中LRO和MRO組低于RO組，MRO組低于LRO組，但差異不顯著(表1)。

GroupnRBP4mRNARBP4(μg/L)C52.098±0.15413.022±2.201CO52.634±0.447*16.000±1.536**RO61.836±0.327##13.587±0.067#LRO52.131±0.111#12.978±1.692##MRO51.732±0.244##12.022±1.642##

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsCO group

2.2 8周干預(yù)后內(nèi)臟脂肪組織RBP4蛋白表達(dá)

CO組內(nèi)臟脂肪組織RBP4蛋白表達(dá)高于C組；RO、LRO及MRO三組內(nèi)臟脂肪組織RBP4蛋白表達(dá)均明顯低于CO組，且RO、LRO及MRO三組間差異不顯著(圖1)。

Fig.1Comparison of protein expression in RBP4 of rats among group after the experiment

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

2.3 8周干預(yù)后ISI和血糖比較

ISI CO組明顯低于C組，差異顯著(P<0.05)。LRO和MRO組明顯高于CO組，差異顯著(P<0.05)；RO組高于CO組，但差異不顯著。LRO和MRO組高于RO組，MRO組高于LRO組，但差異不顯著。血糖CO組明顯高于C組，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。MRO組明顯低于CO組，差異顯著(P<0.05)，RO和LRO組血糖低于CO組，但差異不顯著(表2)。

GroupnISIBloodsugar(mmol/L)C50.394±0.01911.636±3.568CO50.369±0.017*17.930±6.094**RO60.381±0.01015.242±2.191LRO50.390±0.015#13.950±2.260MRO50.391±0.009#12.894±2.642#

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05vsCO group

3 討論

隨著年齡增長，老年人身體成分發(fā)生重要變化，老年人群傾向于肥胖化[11]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織是重要的內(nèi)分泌器官，其分泌的細(xì)胞因子能以自分泌、旁分泌和遠(yuǎn)距離分泌等多種途徑參與調(diào)節(jié)胰島素在靶組織中的生物效應(yīng)[12]。大量脂肪因子表達(dá)的增加或減弱，可從不同程度影響胰島素效應(yīng)，促成IR，進(jìn)而形成T2DM[1]。

RBP4是新近發(fā)現(xiàn)的能導(dǎo)致IR的脂肪細(xì)胞因子，是單一肽鏈蛋白質(zhì)，除了在肝臟中表達(dá)外，在脂肪組織尤其是內(nèi)臟脂肪組織中高表達(dá)，是肥胖與T2DM之間的連接分子。Yang等[1]研究發(fā)現(xiàn)：RBP4抑制肌肉組織磷脂酰肌醇3激酶的活性和胰島素受體后底物1的磷酸化，使其攝取葡萄糖減少；同時RBP4還誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)糖異生的酶，增加肝糖輸出，導(dǎo)致IR，從而參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。Kloting等[13]研究證明，與正常者相比，肥胖患者內(nèi)臟RBP4 mRNA升高約60倍，睪周脂肪RBP4 mRNA升高約12倍，提示內(nèi)臟脂肪分泌的RBP4可能是肥胖患者RBP4的主要來源。常保榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，運動可以改善老年大鼠的食欲和身體成分，提高活動能力，減脂及降低體重。封飛虎等[15]采用運動與飲食對肥胖大鼠干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，運動結(jié)合飲食可以降低腹內(nèi)脂肪組織RBP4 mRNA表達(dá)水平。林宇峰等[16]通過對T2DM肥胖大鼠研究發(fā)現(xiàn)，8周耐力運動能夠逆轉(zhuǎn)受試鼠的脂肪組織RBP4蛋白表達(dá)水平的上調(diào)和降低血RBP4濃度，有效的改善了ISI及脂代謝。本實驗發(fā)現(xiàn)，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織RBP4 mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)、血漿濃度均顯著增高，單純補充Res和運動結(jié)合Res能明顯降低其基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯以及血漿濃度，同時也低于正常老年大鼠。因該方面的研究文獻(xiàn)很少，本人認(rèn)為運動結(jié)合Res對RBP4的降低可能是預(yù)防老年人T2DM發(fā)生的有效保健措施，但確切機制有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟型肥胖與糖尿病的相關(guān)性更強，運動可以改善T2DM大鼠脂代謝紊亂，降低血糖濃度，增加胰島素的敏感性[17]。Lee等[18]在老年肥胖人群中研究RBP4和IR的關(guān)系，結(jié)果顯示RBP4水平與空腹胰島素、IR呈正相關(guān)，增加了糖尿病的發(fā)病風(fēng)險。通過長期科學(xué)鍛煉，可降低其IR，改善ISI，降低血RBP4水平，從而控制血糖波動、降低血糖。

Res及其衍生物是近年來研究較多的一類植物抗毒素，以反式和順式兩種同分異構(gòu)體的形式存在[4]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，Res可改善ISI，降低糖尿病動物的血糖，調(diào)節(jié)脂代謝異常，減少炎癥因子的分泌和表達(dá)。曹姣等[20]通過有氧運動和Res對肥胖大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響研究發(fā)現(xiàn)，其聯(lián)合干預(yù)改善肥胖大鼠脂代謝紊亂的效果優(yōu)于單純干預(yù)。

本研究發(fā)現(xiàn)老年肥胖大鼠血漿RBP4濃度明顯增加，ISI降低，血糖升高。通過不同強度運動結(jié)合Res干預(yù)能夠顯著降低RBP4血漿濃度，提高ISI，降低血糖，受運動強度影響較小。運動結(jié)合Res聯(lián)合作用效果明顯優(yōu)于單純補充Res，說明補充Res在運動的刺激下能發(fā)揮更好的保健作用。

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EffectsofdifferentintensitiesexercisecombinedwithresveratrolonRBP4inagedobeserats

CUI Jia-qing, BAI You-ping△, SU Min, SONG Wei-wei, LIN Chan, WU Lin, ZHANG Hao-yue

(College of Physical Education，Anhui Normal University, Wuhu 241003, China)

Objective: To investigate the effects of different intensity exercise combined with resveratrol on retinol binding protein 4(RBP4) mRNA and protein expression in visceral adipose tissue and plasma RBP4 concentration of aged obese rats.MethodsEighty male SD rats aged 3 weeks were randomly divided into the control group and the experimental group. Rats of the control group(C) were fed with ordinary feed of 6% fat (n=12). The experimental group consisted of 68 rats, which were fed with 36%～40% high fat feed in three stages. The rat model of elderly obesity was established successfully. Twenty-four obese rats were selected and randomly divided into 4 groups, including obese group (CO), resveratrol obese group (RO), low intensity exercise combined with resveratrol group (LRO) and moderate intensity exercise combined with resveratrol group (MRO). There were 6 rats in each group. The exercise intensities of the LRO group and MRO group were (12 m/min ×15 min) and (15 m/min × 15 min). Every day was exercised for 60 minutes. The rats in RO, LRO or MRO were treated with resveratrol at the dose of 52.5 mg/kg·d, while the rats in the control group were fed with the same amount of purified water, continued intervention for 8 weeks. After 8 weeks, samples of blood, adipose tissue of around the kidney, testicle, vessel and visceral were collected. Blood glucose and plasma RBP4 concentration were measured. Insulin sensitivity(ISI) was calculated. The expressions of RBP4 mRNA and protein were also determined.ResultsCompared with normal (C) group, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the model (CO) group were increased obviously (P<0.05,P<0.01). ISI was decreased obviously (P<0.05). Compared with model (CO) group, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the RO and LRO and MRO groups were decreased significantly(P<0.05,P<0.01), while ISI was increased markedly (P<0.05). Compared with the RO and LRO groups, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the MRO group were decreased, while ISI was increased, but there was no significant difference.ConclusionDifferent intensities exercise combined with resveratrol could reduce the RBP4 mRNA and protein expression in visceral adipose tissue and plasma RBP4 concentrations of aged obese rats, but less affected by exercise intensity.

exercise intensity; resveratrol; aged obesity; retinol binding protein 4

G804.2

A

1000-6834(2017)05-461-05

10.12047/j.cjap.5527.2017.110

安徽省高校自然科學(xué)基金重點(KJ2017A238)；安徽師范大學(xué)研究生科研創(chuàng)新與實踐重點項目(2016yks011)

2016-11-24

2017-06-23

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