徐成波, 廖 斌, 沈建箴, 付海英, 林 婷

(1. 福建省人民醫(yī)院 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科， 福州 350004；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科 福建省血液病研究所， 福州 350001)

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡及組蛋白H3K4甲基化的影響*

徐成波1△, 廖 斌1, 沈建箴2, 付海英2, 林 婷1

(1. 福建省人民醫(yī)院 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科， 福州 350004；2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科 福建省血液病研究所， 福州 350001)

目的探討雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞增殖、凋亡和組蛋白H3K4甲基化的影響。方法以人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226為研究對(duì)象，在不同濃度(10、20、40、80、160 nmol/L)TPL中共培養(yǎng)不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)后，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；Western blot法檢測組蛋白H3K4me2、H3K4me3的甲基化狀態(tài)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析組蛋白甲基化酶SMYD3和組蛋白去甲基化酶LSD1的表達(dá)水平。結(jié)果TPL對(duì)RPMI8226細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，呈劑量和時(shí)間依賴性(P<0.05)；TPL對(duì)RPMI8226細(xì)胞有明顯誘導(dǎo)凋亡的作用，并且隨著TPL作用濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例逐漸增加(P<0.05)；同時(shí)TPL還可以誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞周期阻滯于G2/M期；TPL以濃度依賴性降低組蛋白H3K4me2、H3K4me3的甲基化水平(P<0.05，P<0.01)，并抑制SMYD3和上調(diào)LSD1的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論TPL可抑制RPMI8226細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，并誘導(dǎo)其凋亡；通過抑制組蛋白甲基化酶SMYD3和增強(qiáng)組蛋白去甲基化酶LSD1的表達(dá)，降低組蛋白H3K4me3和H3K4me2的甲基化水平，這可能是TPL誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

雷公藤內(nèi)酯醇；多發(fā)性骨髓瘤；凋亡；組蛋白；甲基化

雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TPL)又稱雷公藤甲素，是從福建省泰寧縣產(chǎn)的傳統(tǒng)中藥雷公藤根皮中分離出含環(huán)氧的二萜內(nèi)酯化合物，臨床研究發(fā)現(xiàn)其

具有顯著的抗炎、抗腫瘤和免疫抑制的藥理作用[1-3]。國內(nèi)外研究證實(shí)，TPL可以通過調(diào)控核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路、Bcl-2基因家族以及熱休克蛋白-70等途徑，抑制多發(fā)性骨髓瘤(mutiple myeloma，MM)細(xì)胞的生長增殖，并誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡[4]。組蛋白甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式之一，廣泛地參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展。最新研究表明，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖、分化過程中，組蛋白3第4位賴氨酸(trimethylation of histone H3 lysine 4，H3K4me3)和組蛋白3第27位賴氨酸(trimethylation of histone H3 lysine 27，H3K27me3)的三甲基化通過修飾抑癌基因的多梳蛋白抑制復(fù)合體-2(polycomb repressive complex-2，PRC-2)，沉默靶基因的表達(dá)。其中Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能夠編碼PRC-2中甲基轉(zhuǎn)移酶的成分，以催化H3K27三甲基化的方式導(dǎo)致腫瘤抑制因子表達(dá)受抑，促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞轉(zhuǎn)化。利用EZH2抑制劑，可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的異常增殖和克隆演變，并且組蛋白的甲基化水平與MM的預(yù)后密切相關(guān)[5]。本課題組前期研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，TPL可明顯抑制白血病細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制與逆轉(zhuǎn)細(xì)胞中抑癌基因p15、p16及大腸腺癌息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)有關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)H3K4me3位點(diǎn)的甲基化水平在多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞中異常增高，是影響凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡受阻，增殖加快的重要原因。因此，基于TPL能夠逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾的作用，本研究以骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞為研究對(duì)象，探討TPL是否可以通過逆轉(zhuǎn)組蛋白H3K4的甲基化模式并誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為TPL通過表觀遺傳調(diào)控途徑靶向治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雷公藤內(nèi)酯醇(美國sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，MTT試劑(美國sigma公司)，RPMI1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，Prime Script RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Advantage qPCR Premix(中國Takara公司)，鼠抗人H3K4me3，H3K4me2單克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗(中杉金橋生物公司)，ECL發(fā)光液(廈門鷺隆生物公司)。引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(中國力康公司)，倒置顯微鏡(日本NiKon公司)，酶標(biāo)儀(美國Awareness公司)，F(xiàn)ACScan型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)，核酸蛋白定量儀(美國Thermo公司)，Western-blot電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226由福建省血液病研究所凍存，由我院中心實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)并保存。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，培養(yǎng)在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈懸浮生長，間隔24～48 h細(xì)胞換液傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖及繪制增殖曲線

收集對(duì)數(shù)生長期的RPMI8226細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105cells/ml并接種于96孔培養(yǎng)板中。分為空白對(duì)照組，TPL藥物作用組，藥物終濃度分別為10、20、40、80、160 nmol/L，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，藥物作用24 h、48 h、72 h后，加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入100 μl二甲基亞楓后在酶標(biāo)儀上檢測570 nm波長下各孔的吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-A藥物組/A對(duì)照組)×100%

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的早期凋亡率

收集TPL終濃度分別為40、80、160 nmol/L，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48 h后的RPMI8226細(xì)胞以及同期的空白對(duì)照組細(xì)胞，按Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作步驟，離心細(xì)胞懸液，去上清后用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為(2～5)×105cells/ml。每份加入195 μl緩沖液及5 μl FIFC-Annexin V，避光孵育10 min，離心，去上清。再每份加入190 μl緩沖液及10 μl碘化丙啶，避光孵育10 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期百分率

收集TPL終濃度分別為40、80、160 nmol/L，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48 h后的RPMI8226細(xì)胞以及同期的空白對(duì)照組細(xì)胞，按細(xì)胞周期檢測試劑盒操作，離心細(xì)胞懸液，吸上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml；加入預(yù)冷的70%乙醇1 ml固定，4℃孵育過夜。離心去除固定液，洗滌細(xì)胞后每份標(biāo)加入100 μl RNase A，37℃水浴30 min，再加入400 μl碘化丙啶，混勻后預(yù)冷至4℃避光30 min后流式細(xì)胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.7Westernblot法檢測組蛋白H3K4me2，H3K4me3的甲基化狀態(tài)

收集TPL終濃度分別為40、80、160 nmol/L，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48 h后的RPMI8226細(xì)胞以及同期的空白對(duì)照組細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞總蛋白。取30 μg上樣總蛋白，行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后電轉(zhuǎn)膜1.5 h至醋酸纖維薄膜上，加5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別與鼠抗人H3K4me2，H3K4me3單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體共孵育4℃過夜，洗膜后分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑后在暗室曝光、顯影、照相及結(jié)果分析。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測組蛋白甲基化酶SMYD3和組蛋白去甲基化酶LSD1的表達(dá)水平

收集TPL終濃度分別為40、80、160 nmol/L，每濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用48 h后的RPMI8226細(xì)胞以及同期的空白對(duì)照組細(xì)胞，Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。應(yīng)用SYBR Advantage qPCR Premix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SMYD3上游引物：5’-CGGAGATGCAGGAAGT-TGGT-3’，下游引物：5’-GTATGGCTCCATGGTCCG-AGT-3’。LSD1上游引物：5’-CAGCCACCAGCCGTTC-AGT-3’，下游引物：5’-CAGCACGCCAACGAGACAC-3’，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照。反應(yīng)體系：SYBR Advantage qPCR Premix 12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，cDNA 2 μl，加水至25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示：不同藥物濃度(10、20、40、80、160 nmol/L)的TPL作用RPMI8226細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)后，RPMI8226細(xì)胞的生長增殖受到不同程度的抑制，且隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，TPL對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。各藥物作用組與空白對(duì)照組增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。隨著作用時(shí)間的延長，其IC50值也逐漸降低，分別是(100.10±1.05)nmol/L，(72.67±1.03)nmol/L，(45.26±1.06)nmol/L。

0： Blank group； 10： TPL 10 nmol/L group； 20： TPL 20 nmol/L group； 40： TPL 40 nmol/L group； 80： TPL 80 nmol/L group； 160： TPL 160 nmol/L group

2.2 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)RPMI8226細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：不同藥物濃度(40、80、160 nmol/L)的TPL作用RPMI8226細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，各藥物組細(xì)胞凋亡比例也逐漸增加，凋亡率分別是(13.43±1.86)、(30.63±1.86)、(41.60±3.31)，而空白對(duì)照組為(5.93±1.33)。各藥物作用組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

0： Blank group； 40： TPL 40 nmol/L group； 80： TPL 80 nmol/L group； 160： TPL 160 nmol/L group

*P<0.05vsblank group

2.3雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：不同藥物濃度(40、80、160 nmol/L)的TPL作用RPMI8226細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，各藥物作用組G0/G1細(xì)胞比例略有減少，S期細(xì)胞比例逐漸減少，G2/M細(xì)胞比例逐漸增加，分別是(11.41±3.04)、(19.89±1.87)、(32.19±2.95)，而空白對(duì)照組為(6.31±3.49)，TPL濃度為80、160 nmol/L作用組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖3)。

0： Blank group； 40： TPL 40 nmol/L group； 80： TPL 80 nmol/L group； 160： TPL 160 nmol/L group

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

2.4雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)RPMI8226細(xì)胞組蛋白H3K4me2、H3K4me3甲基化狀態(tài)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：不同藥物濃度(40、80、160 nmol/L)的TPL作用RPMI8226細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，各藥物組細(xì)胞組蛋白H3K4me3，H3K4me2的甲基化水平呈濃度依賴性下降。各藥物作用組與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，圖4)。

2.5雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)RPMI8226細(xì)胞SMYD3和LSD1mRNA表達(dá)水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示：不同藥物濃度(40、80、160 nmol/L)的TPL作用RPMI8226細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，各藥物組細(xì)胞SMYD3的mRNA表達(dá)水平呈濃度依賴性下降，與空白對(duì)照組比較，分別下降了0.53、0.61、0.79倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而LSD1的mRNA表達(dá)水平逐漸升高，與空白對(duì)照組相比，分別升高了1.35、2.18、2.70倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

0： Blank group； 40： TPL 40 nmol/L group； 80： TPL 80 nmol/L group； 160： TPL 160 nmol/L group; H3K4me3: Trimethylation of histone H3 lysine 4

*P<0.05,**P<0.01vsblank group

0： Blank group； 40： TPL 40 nmol/L group； 80： TPL 80 nmol/L group； 160： TPL 160 nmol/L group； SMYD3： SET and MYND domain containing 3; LSD1: Lysine specific demethylase 1

*P<0.05vsblank group

3 討論

TPL是從衛(wèi)矛科屬木質(zhì)藤本植物雷公藤的根皮中分離出的生物活性較強(qiáng)的有效成份，它作為一種傳統(tǒng)中藥，既往主要應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，TPL還具有廣譜的抗腫瘤的作用，尤其是對(duì)多種髓系及淋巴細(xì)胞白血病，B細(xì)胞淋巴瘤等血液腫瘤具有較好的抗癌活性[9]。TPL的抗腫瘤作用是通過直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，以及激活Caspase家族通路，誘導(dǎo)p53基因表達(dá)，活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)和抑制NF-κB的表達(dá)等途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期阻滯和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥[10-12]。本研究采用MTT法分析發(fā)現(xiàn)TPL對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，隨著TPL作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高，而IC50值逐漸降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示TPL呈劑量依賴性地誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，并且細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，這與國內(nèi)研究[13]的結(jié)果一致。

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指不涉及DNA 堿基序列改變的可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控研究，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 等[14，15]，這種調(diào)控途徑被認(rèn)為是一種極有前景的血液腫瘤治療方法。目前，研究主要集中在DNA甲基化酶抑制劑逆轉(zhuǎn)抑癌基因的過甲基化恢復(fù)基因表達(dá)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑恢復(fù)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)激活轉(zhuǎn)錄，如地西他濱治療骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)和老年急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)，西達(dá)本胺對(duì)復(fù)發(fā)難治的T細(xì)胞淋巴瘤均顯示有良好的治療效果，而選擇性靶向干預(yù)組蛋白甲基化的研究較少。組蛋白甲基化修飾作為表觀遺傳調(diào)控的重要方式之一，主要是在組蛋白甲基化酶(histone methyltransferase，HMT)和組蛋白去甲基化酶(histone demethyltransferase，HDM)的共同作用下動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化水平，從而影響細(xì)胞的增殖和分化，在細(xì)胞周期、凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作用。H3K4me2和H3K4me3一般定位于基因啟動(dòng)子區(qū)域，主要功能為激活基因轉(zhuǎn)錄，而H3K27、H3K9等則與基因沉默有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，H3K4me3通常在活化基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域高度聚集，通過識(shí)別轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)分子來促進(jìn)基因表達(dá)，此種修飾與癌基因轉(zhuǎn)錄效率之間存在密切關(guān)聯(lián)，H3K4me3表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞的凋亡越慢。在部分多發(fā)性骨髓瘤患者中，由于t(4，14)染色體的易位，導(dǎo)致核受體結(jié)合SET結(jié)構(gòu)域蛋白2(nuclear receptor-binding SET domain-protein 2，NSD2)基因過度表達(dá)，NSD2是HMT家族成員之一，主要功能為修飾組蛋白H3K36和H4K20的甲基化，影響基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖，與多發(fā)性骨髓瘤的形成和預(yù)后密切相關(guān)[16]。Zhao等[17]研究顯示，TPL可以通過下調(diào)組蛋白甲基化酶EZH2和花斑3-9抑制因子同源物1(suppressor of variegation 3-9 Homolog l，SUV39H1)，分別降低組蛋白H3K27me3和H3K9me3的甲基化水平，抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。我們的研究結(jié)果顯示，TPL作用RPMI8226細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞組蛋白H3K4me2、H3K4me3的甲基化水平呈濃度依賴性下降。

為進(jìn)一步研究TPL影響H3K4me2、H3K4me3甲基化狀態(tài)的機(jī)制，我們同時(shí)檢測了組蛋白甲基化酶SET和MYND結(jié)構(gòu)域含有蛋白3(SET and MYND domain containing 3，SMYD3)、賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)的表達(dá)。

SMYD3是一個(gè)含SET和MYND區(qū)域的蛋白，在肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)異常的高表達(dá)。它可以接受S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，特異性地使組蛋白H3K4發(fā)生二甲基化和三甲基化，造成染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化，從而影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的接近和下游癌基因、凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[18]。在乳腺癌細(xì)胞中，SMYD3作為雌激素受體介導(dǎo)的輔助轉(zhuǎn)錄激活因子，SMYD3的表達(dá)下調(diào)可使靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中雌激素反應(yīng)元件的H3K4甲基化水平下降，使癌基因表達(dá)受抑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。此外，SMYD3的過度表達(dá)可導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein，MMP-9)在纖維肉瘤細(xì)胞、乳腺癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，對(duì)腫瘤的形成具有重要作用，而SMYD3表達(dá)沉默可以使MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K4甲基化水平降低，從而導(dǎo)致MMP-9基因表達(dá)減少[20]。本研究顯示，在不同濃度的TPL作用下，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中H3K4me2和H3K4me3甲基化水平降低的同時(shí)，呈劑量依賴性的下調(diào)SMYD3的蛋白表達(dá)水平，因而我們推測TPL可能是通過下調(diào)SMYD3的表達(dá)來影響H3K4的甲基化狀態(tài)，從而抑制細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

LSD1是組蛋白H3K4的單甲基化(H3K4me)和雙甲基化(H3K4me2)的特異性去甲基化酶。LSD1定位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，它的表達(dá)異常與多種腫瘤密切相關(guān)，往往聚集表達(dá)于癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄激活和腫瘤形成。Scoumanne A等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LSD1能夠抑制p53的生物學(xué)活性，抑制p53信號(hào)途徑的傳遞，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)生。Kontaki 等[22]研究證實(shí)，當(dāng)DNA受到損傷后，LSD1可以去甲基化修飾E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F transcription factor 1，E2F1)的第185位賴氨酸，使其去甲基化，E2F1被激活后轉(zhuǎn)錄活性大大增強(qiáng)，并進(jìn)一步乙酰化和磷酸化，同時(shí)參與細(xì)胞周期G1期到S期的轉(zhuǎn)換，通過p53依賴和非p53依賴途徑誘導(dǎo)下游凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄激活。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的TPL作用后，隨著H3K4me2甲基化水平的下降，LSD1蛋白表達(dá)水平逐漸增加。我們認(rèn)為，TPL誘導(dǎo)LSD1的表達(dá)增高導(dǎo)致了H3K4me2去甲基化，使得腫瘤細(xì)胞中癌基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化缺失，癌基因轉(zhuǎn)錄激活受抑，腫瘤細(xì)胞的存活也被抑制。

總之，本研究顯示TPL能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞的生長增殖，引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。提示SMYD3和LSD1可能是TPL抗多發(fā)性骨髓瘤的作用靶點(diǎn)之一。該研究初步闡明了TPL通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化酶和去甲基化酶導(dǎo)致組蛋白表觀遺傳學(xué)修飾的改變，進(jìn)而影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究TPL的抗多發(fā)性骨髓瘤作用奠定了理論基礎(chǔ)。

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EffectsoftriptolideontheapoptosisandH3K4proteinmethylationinmultiplemyelomacells*

XU Cheng-bo1△， LIAO Bin1， SHEN Jian-zhen2， FU Hai-ying2， LIN Ting1

(1. Department of Hematology， The People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350004；2. Department of Hematology， The Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Fujian Institute of Hematology， Fuzhou 350001, China)

Objective: To investigate the effects of triptolide (Chinese Traditional Medicine)on the apoptosis and H3K4 protein methylation in multiple myeloma cells.MethodsThe RPMI8226 cells were cultured with different concentrations(10，20，40，80 and 160 nmol/L)of triptolide for different incubation time (24 h，48 h and 72 h). The inhibition of triptolide on RPMI8226 cell proliferation was detected by MTT assay. Apoptosis and cell cycle distribution were evaluated by flow cytometry.The expressions of H3K4me2 and trimethylation of histone H3 lysine 4(H3K4me3) in RPMI8226 cells were assayed by Western blot. The changes of expressions of histone methylase SET and MYND domain containing 3(SMYD3) and histone demethylase lysine specific demethylase 1(LSD1) in RPMI8226 cells were verified by qRT-PCR.ResultsTriptolide had obvious inhibitive effects on proliferation of RPMI8226 cells and showed a dose- and time-dependent manner(P<0.05). Triptolide induced apoptosis and G2/M cell cycle arrest in a dose-dependent manner(P<0.05). Triptolide decreased histone H3K4me2 and H3K4me3 expression in a dose-dependent manner(P<0.05,P<0.01). SMYD3 was significantly depressed at protein expression in a dose-dependent manner(P<0.05)， but LSD1 was up-regulated (P<0.05).ConclusionTriptolide could inhibit RPMI8226 cell proliferation，induce the apoptosis and cause G2/M arrest，meanwhile，significantly inhibit the protein expressions of H3K4me2 and H3K4me2 with alter the expression of SMYD3 and LSD1.The effects is probably related to the antitumor mechanism of MM cells induced by triptolide.

triptolide； multiple myeloma； apoptosis； histone protein； methylation

*【收稿日期】2017-01-19 【修回日期】2017-05-15

R559

A

1000-6834(2017)05-450-06

10.12047/j.cjap.5483.2017.108

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015J01327)；福建省衛(wèi)計(jì)委青年科研基金(2016-1-77)

2016-08-02

2017-05-16

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Tel： 13655038240； E-mail： albertsky@163.com