剛 琳, 李一鵬, 盧 磊, 楊 凱, 孫中磊, 陳旭義, 涂 悅△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300193； 2. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心， 腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室， 天津 300162； 3. 錦州醫(yī)科大學(xué)， 錦州 121001)

Slit2N與絲素蛋白混合物誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元遷移的體外模型建立*

剛 琳1,2, 李一鵬1,2, 盧 磊1,2, 楊 凱2,3, 孫中磊2,3, 陳旭義2, 涂 悅1,2△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300193； 2. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心， 腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室， 天津 300162； 3. 錦州醫(yī)科大學(xué)， 錦州 121001)

目的利用Slit排斥導(dǎo)向遷移和絲素蛋白，探索建立簡便可行、經(jīng)濟實惠、作用持久的神經(jīng)元導(dǎo)向遷移模型新方法。方法提取SD新生鼠海馬組織，以專用細胞培養(yǎng)片體外培養(yǎng)神經(jīng)元，分為空白對照組、單純絲素蛋白、單純Slit 2N和Slit 2N與絲素蛋白混合物組(以下簡稱混合物組)，分別隨機選擇不同視野下50個神經(jīng)元，用顯微鏡拍照記錄胞體坐標及突起狀態(tài)，除空白對照組外，其他3組均距每個神經(jīng)元100 μm處添加相應(yīng)誘導(dǎo)物，共觀察30 min，再次記錄后，用免疫熒光染色法鑒定細胞性質(zhì)及其陽性率。結(jié)果單純Slit 2N組和混合物組均可見突起向濃度低處遷移或彎曲，且長度有所縮短，空白對照組和單純絲素蛋白組未見明顯變化。突起變化的平均持續(xù)時間及平均長度差從大到小依次為混合物組、單純Slit 2N組、單純絲素蛋白組(P<0.05)，單純絲素蛋白組和空白對照組間無明顯變化(P>0.05)。四組神經(jīng)元MAP-2陽性率均達到90%以上。結(jié)論絲素蛋白對Slit 2N誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元遷移作用無明顯影響，可有效減緩Slit 2N擴散速度，使作用時間延長，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病建立三維神經(jīng)定向修復(fù)提供有利的體外實驗構(gòu)建基礎(chǔ)。

Slit 2N；絲素蛋白；海馬神經(jīng)元；神經(jīng)導(dǎo)向；神經(jīng)遷移；神經(jīng)修復(fù)；大鼠

神經(jīng)系統(tǒng)疾病在不同程度上均會有神經(jīng)連接結(jié)構(gòu)的改變，其分子機制尚不明確。最新研究發(fā)現(xiàn)軸

突導(dǎo)向蛋白與此有關(guān)，它在功能或表達上發(fā)生變異后可以引起神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)病理性改變，同時神經(jīng)導(dǎo)向蛋白缺損還會影響心血管和免疫系統(tǒng)疾病，從而直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對治療脊髓損傷、軸索損傷、阿爾茨海默病、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有非常重要的意義[1]。Slit是具有排斥作用的神經(jīng)導(dǎo)向蛋白之一，它包含3個亞型(Slit 1，Slit 2，Slit 3)，能與Robo受體家族結(jié)合，主要在大鼠胚胎期和新生期腦隔區(qū)分布，依靠濃度梯度實現(xiàn)排斥性神經(jīng)細胞遷移作用。有研究表明，Slit 2對海馬神經(jīng)元軸突有排斥及抑制生長作用，并參與神經(jīng)纖維及突觸形成[2]。Slit 2具有N端和C端，目前針對它的體內(nèi)分子機制已逐步闡明，但體外模型構(gòu)建方法依然缺乏。有研究通過高通量微流體裝置檢測導(dǎo)向蛋白濃度梯度[3]，亦有研究利用顯微探針‘一面添加、一面吸出’形成濃度梯度誘導(dǎo)后，通過長時程同步拍攝顯微鏡實時記錄軸突變化[4，5]。此類模型構(gòu)建復(fù)雜，濃度保持時間較短，誘導(dǎo)物需用量大，儀器價格昂貴，不利于廣泛推廣。因此本研究利用絲素蛋白良好的生物相容性，與Slit 2N混合，減緩誘導(dǎo)物擴散速度，降低誘導(dǎo)物使用量，再利用微尺蓋塑片，構(gòu)建經(jīng)濟實惠、操作簡單的大鼠海馬神經(jīng)元導(dǎo)向體外模型，為未來三維神經(jīng)修復(fù)及Slit基因生物學(xué)功能研究提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生12 h內(nèi)SD大鼠30只，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與材料

人重組Slit 2N(Peprotech，美國)，絲素蛋白(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所提供)，微尺蓋塑片(Cellattice，中國)，20 mmol/L pH 8.8 Tirs溶液(Sigma，美國)，150 mmol/L NaCl溶液(Sigma，美國)，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體(Abcam，美國)，紅色標記山羊抗兔二抗(Life，美國)，磷酸鹽緩沖液PBS(phosphate buffered saline，Solarbio，中國)，胎牛血清FBS(fetal bovine serum，Gibco，美國)，Neurobasal培養(yǎng)基(Life，美國)，DMEM/ F-12 1∶1培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle media: nutrient mixture F-12 1∶1，Hyclone，美國)，D-hank’s緩沖液(上海培源，中國)。4%多聚甲醛溶液(Solarbio，中國)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，Solarbio，中國)，牛血清白蛋白BSA(bovine serum albumin，Sigma，美國)，多聚賴氨酸(Sigma，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗(以下簡稱雙抗，Solarbio，中國)，2.5 %胰蛋白酶(Solarbio，中國)。

1.3 實驗分組與誘導(dǎo)物配置

提取大鼠海馬組織，以微尺蓋塑片體外(圖 1)接種神經(jīng)元，培養(yǎng)72 h后分為4組，空白對照組不添加誘導(dǎo)物，單純絲素蛋白組的誘導(dǎo)物為絲素蛋白，單純Slit 2N組的誘導(dǎo)物為8 μg/ml Slit 2N，混合物組的誘導(dǎo)物為8 μg/ml Slit 2N與絲素蛋白混合物。人重組Slit 2N來源于HEK 293細胞，為神經(jīng)導(dǎo)向研究常用藥物。Slit 2N母液配制：原粉末開蓋前離心，在超凈臺內(nèi)以20 mmol/L pH 8.8 Tris+150 mmol/L NaCl緩慢溶解至1.0 mg/ml，溶解時間為2 h，分裝儲存于-20℃或-80℃冰箱內(nèi)。稀釋方法：配制時需在超凈臺內(nèi)進行，將1.0 mg/ml Slit 2N母液以PBS稀釋125倍至8 μg/ml，儲存于-20℃或4℃冰箱內(nèi)。Slit 2N與絲素蛋白混合物組配制：取1.0 mg/ml Slit 2N母液在超凈臺內(nèi)，以絲素蛋白稀釋125倍至8 μg/ml，儲存于-20℃或4℃冰箱內(nèi)。

Fig.1The physical and schematic illustration of cellatticeTMmicro-ruled plastic coverslip

1.4 原代海馬神經(jīng)元提取和體外培養(yǎng)

1.4.1 準備工作 實驗前4 d，將微尺蓋塑片放于一次性無菌細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，于75%醫(yī)用乙醇中浸泡24 h。實驗前3 d，在超凈臺內(nèi)將微尺蓋塑片用無菌鑷輕柔移入6孔板內(nèi)，紫外照射反正面各12 h。實驗前2 d，將提取所用耗材、器械清洗干凈后，75%醫(yī)用乙醇浸泡12 h，再將PBS與之同時高溫加壓滅菌，烘干耗材及器械。向裝有消毒殺菌后的微尺蓋塑片6孔板內(nèi)加入DMEM/ F-12 1:1培養(yǎng)基，每孔3 ml，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。實驗前1 d，取出6孔板于倒置相差顯微鏡下觀察是否有污染。拋棄污染孔內(nèi)培養(yǎng)基并作標記，更換未污染孔內(nèi)培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)，操作中防止交叉污染。隨后配制A液、B液、C液及0.025%多聚賴氨酸，均儲存于4℃冰箱內(nèi)備用；實驗前1 d，鋪板，取出6孔板置于超凈臺內(nèi)，拋棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用無菌PBS清洗2 min×3次，晾干后取0.025%多聚賴氨酸，每孔200 μl，鋪于微尺蓋塑片中央標尺范圍內(nèi)，于37℃培養(yǎng)箱過夜。A液：取60 ml DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基，加入1%雙抗；B液：取60 ml DMEM/ F-12 1:1培養(yǎng)基，加入1%雙抗和10%FBS；C液：取60 ml Neurobasal培養(yǎng)基，加入1%雙抗。

1.4.2 提取步驟 取出6孔板，回收0.025%多聚賴氨酸，用無菌PBS清洗2 min×3次，加入C液，每孔3 ml，置于37℃培養(yǎng)箱備用。超凈臺及無菌操作臺上擺放相應(yīng)無菌器械和容器。以下所有步驟均在無菌操作臺內(nèi)冰上進行，注意過程中無菌操作：培養(yǎng)皿中放入3～4 ml A液；取一只新生鼠(圖 2a，圖2見彩圖頁Ⅰ)，放入盛有100 ml 75%醫(yī)用乙醇的小燒杯中浸泡1 min，再移至裝有10 ml 75%醫(yī)用乙醇的培養(yǎng)皿中翻轉(zhuǎn)消毒1 min，無菌PBS沖洗表面乙醇；將新生鼠放入空的無菌培養(yǎng)皿中斷頭(圖2b)，軀體部分棄于廢物盤內(nèi)；左手執(zhí)鑷固定鼠鼻，右手從枕葉向額葉剪開皮肉(圖2c)；右手換剪，繼續(xù)按相同方向剪開顱骨；換用眼科鑷，輕柔撥開顱骨，再用眼科剪剪開硬腦膜(圖2d)；用眼科彎鑷，緩慢挑出全腦(圖2e)，置于裝有A液的無菌培養(yǎng)皿中(圖2a)；剝離小腦(圖2f-g)，分離左右大腦半球，使其腹面朝上(圖2h)；在體視解剖顯微鏡下剝離中腦，暴露海馬組織(圖2i)；繼續(xù)剝?nèi)『ｑR組織，分離包裹的血管網(wǎng)膜(圖2j)；將海馬組織放入裝有1 ml D-hank’s緩沖液的1.5 ml無菌離心管中，每管最多可放4條海馬組織。

1.4.3 培養(yǎng)操作 以下步驟均在超凈臺內(nèi)進行，輕柔吹打時以不起泡沫為宜：將所有海馬組織取出，放入裝有10 ml D-hank’s緩沖液的15 ml無菌離心管內(nèi)，輕柔吹洗3次，靜置2 min；待海馬組織全部沉淀后，吸出上清液，再加入10 ml A液輕柔吹洗3次，靜置2 min，待海馬組織沉淀后吸出上清液，重復(fù)2次；加入9 ml A液和1 ml 2.5 %胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min；加入1 ml B液混勻停止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；再滴加10 ml B液輕柔吹打1 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入5 ml B液后全部移入100 mm無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿傾斜30°擺放，輕柔吹打30次；經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，收集于離心管內(nèi)，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入3 ml B液，輕柔吹打至單細胞懸液計數(shù)。取出6孔板，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，重新加入B液，每孔2 ml；每孔種20～30萬個細胞，最后用B液調(diào)整各孔培養(yǎng)基至3 ml，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。鏡下觀察細胞是否貼壁，再于超凈臺內(nèi)輕晃兩下，吸出培養(yǎng)基，加入C液，每孔3 ml，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.5 神經(jīng)元遷移體外模型制備

取出6孔板內(nèi)任意一孔內(nèi)的微尺蓋塑片，放入35 mm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入3 ml C液，置于倒置相差顯微鏡下隨機選取視野，尋找生長狀態(tài)良好且未聚團的細胞，拍照并記錄胞體坐標，再用顯微注射器于距離神經(jīng)元突起100 μm 處緩慢添加誘導(dǎo)物20 μl并持續(xù)觀察30 min[4]，空白對照組不添加任何誘導(dǎo)物，只持續(xù)觀察30 min，四組均實時對其進行連拍記錄。每組分別隨機選擇不同視野下50個神經(jīng)元進行統(tǒng)計、比對誘導(dǎo)效果持續(xù)時間及細胞突起長度變化前后差值(長度差=變化前-變化后)，隨后對神經(jīng)元進行MAP-2免疫熒光染色鑒定。

1.6 免疫熒光染色鑒定

將微尺蓋塑片放于新的6孔板內(nèi)，使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2 min×3次；加0.5% Triton X-100的PBS透化處理20 min后吸出，PBS清洗2 min×3次；加入5%BSA封閉處理20 min后，每張微尺蓋塑片滴加200 μl兔抗大鼠MAP-2多抗(用PBS以1∶200稀釋)于4℃冰箱過夜。過夜后室溫復(fù)蘇40 min，吸出一抗，PBS清洗2 min×3次；在每張微尺蓋塑片滴加200 μl紅色標記山羊抗兔二抗(用PBS以1∶200稀釋)，放于37℃溫箱孵育30 min后吸出，PBS搖床清洗5 min×3次；用PBS以1∶100稀釋DAPI后滴加于微尺蓋塑片上，常溫10 min，PBS搖床清洗5 min×3次；晾干后緩沖甘油封片，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞性質(zhì)和陽性率，陽性細胞為神經(jīng)元，鏡下表現(xiàn)為紅色細胞質(zhì)和藍色細胞核。染色過程動作需輕柔，防止脫片，透化處理時須靜置。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)

細胞開始接種時，胞體呈圓形、透亮、單個均勻懸浮狀分布(圖 3a)；4～5 h后細胞開始貼壁；12～24 h后細胞全部貼壁，并伸出小的突起(圖 3b)；48 h后開始分化(圖 3c)，胞體呈錐形或梭形，大部分細胞突起明顯，末端呈膨大錐樣結(jié)構(gòu)，有少量神經(jīng)膠質(zhì)細胞；72 h后細胞呈典型神經(jīng)元特征(圖 3d)，胞體增大，呈梭形、錐形或多邊形，核大，突起顯著增長，鏡下可見明顯生長錐樣結(jié)構(gòu)，大部分細胞尚未交織成纖維網(wǎng)絡(luò)，生長錐相互分開，說明細胞在微尺蓋塑片上能夠良好的生長。

2.2 細胞突起變化情況

在顯微注射同劑量的誘導(dǎo)物后，經(jīng)微尺測量細胞突起長度結(jié)果顯示，單純Slit 2N組和混合物組的細胞突起均有所縮短，且偶有突起發(fā)生彎曲遷移現(xiàn)象(圖 4)，而單純絲素蛋白組和空白對照組未見明顯變化：細胞突起變化前后的平均長度差從大到小依次為混合物組、單純Slit 2N組、單純絲素蛋白組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，圖4)；細胞突起變化的平均持續(xù)時間從長到短依次為混合物組、單純Slit 2N組、單純絲素蛋白組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，圖4)。誘導(dǎo)觀察30 min后，3組濃度均趨于穩(wěn)定，與空白對照組相比，單純Slit 2N組和混合物組的細胞突起變化前后平均長度差和平均持續(xù)時間均有明顯差異，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖4)；但單純絲素蛋白組與空白對照組相比，兩組的細胞突起變化前后平均長度差和平均持續(xù)時間均無明顯差異，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖4)。

Fig.3Light microscopy was used to observe hippocampal neurons culturedinvitro

a: The suspension cells in the inoculation culture were individual; b: The cells had adhered within 24 h; c: The cells had been differentiating after 48 h; d: The cells showed typical neuron characteristics after 72 h. Scale bars in the a b c of pictures are 100 μm. Scale bars in the last one is 50 μm

Tab.1Average of length difference and duration of the four groups before and after neurites changed

GroupAverageofduration(min)Averageoflengthdifference(μm)A0.03±0.160.05±0.98B0.04±0.280.46±1.62C3.76±1.03*#12.56±1.72*#D7.97±1.35*△#22.74±2.15*△#

A: Control group; B: Pure silk fibroin group; C: Pure Slit 2N group; D: Mixture group

*P<0.05vsA;#P<0.05vsB;△P<0.05vsC

2.3 免疫熒光染色結(jié)果

MAP-2免疫熒光染色結(jié)果顯示，空白對照組、單純絲素蛋白組、單純Slit 2N組和混合物組神經(jīng)元陽性率分別為92%，90%，96%，94%。部分陰性細胞突起對誘導(dǎo)物無明顯反應(yīng)(圖5，見彩圖頁Ⅰ)。

Fig.4Light microscopy was used to observe the changes of neurite induced by Slit 2N(Scale bar=50 μm)

The arrows represent the direction of the diffusion of Slit 2N, as the concentration gradient. a: The position of neurite before induction; b: It had the obvious bending after induction

3 討 論

神經(jīng)導(dǎo)向蛋白與網(wǎng)絡(luò)病理性結(jié)構(gòu)連接改變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。它們在腦部發(fā)育時期發(fā)揮吸引或排斥作用，例如Slit蛋白。Slit蛋白相對分子質(zhì)量約為 200 kDa，包含1個N-末端信號肽 (ss)、4個亮氨酸豐富區(qū) (leucine-rich repeat, LRR)、幾個表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF) 樣重復(fù)序列、1個ALPS (agrin-laminin-perlecan-slit)結(jié)構(gòu)域和1個C-末端富含半胱氨酸序列 (cysteine knot)[6]。除胚胎時期外，Slit蛋白還在神經(jīng)功能建立(神經(jīng)元遷移)以及成人神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中發(fā)揮作用(調(diào)控突觸可塑性)。目前對Slit 2N最佳誘導(dǎo)濃度及最佳誘導(dǎo)距離尚不明確，近年來實驗研究中常用濃度為4 μg/ml、8 μg/ml，以后者居多，常選誘導(dǎo)距離為100 μm[4,5,7,8]，因此本研究參照8 μg/ml，距離神經(jīng)元突起100 μm處添加誘導(dǎo)物進行實驗。絲素蛋白作為一種天熱高分子生物材料，具有良好的生物相容性，能提供穩(wěn)定的再生環(huán)境，且比膠原蛋白降解速率更慢，是近年來三維神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管材料研究及開發(fā)的焦點[9]。本研究旨在利用絲素蛋白來減緩Slit 2N在培養(yǎng)基中的擴散速度。觀察本研究中干預(yù)后四組神經(jīng)突起變化平均持續(xù)時間結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純絲素蛋白對Slit 2N擴散速率起到很好的延緩作用，從而使Slit 2N濃度梯度的排斥作用時間增加；單純Slit 2N組中濃度梯度維持時間較短，培養(yǎng)基內(nèi)濃度很快趨于平穩(wěn)，從而形成不了誘導(dǎo)梯度；而單純絲素蛋白不具有排斥作用。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Slit對神經(jīng)元軸突的排斥導(dǎo)向作用是通過促進生長錐上的Nogo蛋白與NgR受體結(jié)合，激活RhoA(Ras homolog gene family，member A)—ROCK信號通路[10]。此通路不但與軸突伸長有關(guān)，還可能會導(dǎo)致生長錐崩解。還有研究表明，軸突導(dǎo)向蛋白是通過影響神經(jīng)元生長錐內(nèi)鈣離子分布，從而使軸突改變運動方向，達到神經(jīng)元靶向遷移的目的[7]。本研究中干預(yù)后3組神經(jīng)突起平均長度差結(jié)果顯示，單純添加絲素蛋白對神經(jīng)導(dǎo)向和遷移作用無明顯影響；單純Slit 2N組和混合物組中均表現(xiàn)出Slit 2N對神經(jīng)突起具有排斥性作用，促使突起向濃度較低的方向移動，甚至伴有生長錐的崩塌，從而導(dǎo)致突起長度縮短，但因混合物組中絲素蛋白延緩了Slit 2N的作用時間，使得該組突起長度較單純Slit 2N組又有所縮短。光鏡下根據(jù)免疫熒光染色特征選取的細胞為神經(jīng)元的概率較高，微尺蓋塑片對大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)可行性較強，可用于測量神經(jīng)元突起長度的變化。

本研究通過已知軸突導(dǎo)向蛋白Slit 2對神經(jīng)元軸突的影響作用，結(jié)合絲素蛋白良好的生物相容性和緩釋作用，在無需持續(xù)添加因子的條件下，構(gòu)建出簡便可行的軸突導(dǎo)向蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元突起遷移的體外模型，解決了進行軸突定向分化等實驗操作，減少了誘導(dǎo)藥物使用量，降低了實驗成本，有助于體外研究脊髓損傷、軸索損傷、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)修復(fù)和再生實驗。這不僅可以避免體內(nèi)眾多作用因素的不利影響，亦可適用于其他軸突導(dǎo)向蛋白家族的體外研究。本研究未來會更深入地探討Slit 2結(jié)合絲素蛋白構(gòu)建三維脊髓微導(dǎo)管模型的構(gòu)建方法和效果研究，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方案提供可能。其次，研究還將面臨一些挑戰(zhàn)，如微尺蓋塑片使用問題以及阿糖胞苷提高神經(jīng)元純度[11]問題-阿糖胞苷具有細胞毒性，本研究尚未添加；微尺蓋塑片不能進行高溫加壓滅菌，會增加細胞污染風(fēng)險。因此，未來需進一步探索和改進問題。

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EstablishmentofneuritismigrationmodelinducedbySlit2Nandsilkfibroinmixtureintherathippocampalneuronsinvitro

GANG Lin1,2, LI Yi-peng1,2, LU Lei1,2, YANG Kai2,3, SUN Zhong-lei2,3, CHEN Xu-yi2, TU Yue1,2△

(1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193; 2. Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Institute of TraumaticBrain Injury and Neurology, Neurological Department of Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese Armed Police Forces, Tianjin 300162; 3. Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

Objective: To explore a simply feasible and affordable method to establish neuritis migration model induced by Slit 2N and silk fibroin mixture in the rat hippocampal neuronsinvitro.MethodsNeurons were derived from SD rat hippocampal tissues and cultured with a special cell culture-plateinvitro. The cultured neurons were divided into four groups, named as control group, pure silk fibroin, pure Slit 2N and Slit 2N mixture with silk fibroin (mixture group), and 50 different neurons were randomly selected in each group. Moreover, we photographed and recorded the soma coordinate and added the silk fibroin, Slit 2N and mixture to each neurite with a distance of 100 μm, except control group. Record again after 30 min. Property and positive rate of cells were identified by immunofluorescence staining.ResultsNeurites of the pure Slit 2N group and the mixture group became shorter, and there was no significant change in the pure silk fibroin and control groups. The results showed that the average duration and length difference before and after changed were in descending order of mixture group, Slit 2N group, silk fibroin group (P<0.05), and the silk fibroin and control groups were no significant change (P>0.05). The positive rate of MAP-2 in four groups was more than 90%.ConclusionThere were no significant effects of Silk fibroin on induced by Slit 2N in rat hippocampal neuron migration. It had an effect on reducing Slit 2N diffusion rate and extending its working time. It provides an advantageous construction methodinvitroon based 3D directed neural repair for the treatment of central nervous system diseases.

Slit 2N; silk fibroin; hippocampal neuron; neural guidance; neural migration; nerve repair; rat

Q2-33

A

1000-6834(2017)05-445-05

10.12047/j.cjap.5563.2017.107

國家自然科學(xué)基金青年項目(11102235)；天津市科技支撐計劃重點項目(14ZCZDGX00500)；天津市衛(wèi)生局科技基金項目(2013KZ134，2014KZ135)

2017-02-04

2017-04-27

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Tel： 13821380288； E-mail: ytumail@vip.126.com