郝 琴， 王會偉， 俞 茜， 沈 娟， 趙 琳， 師芳芳， 陳美霓， 楊彥玲△

(1. 延安大學醫(yī)學院， 2. 延安大學附屬醫(yī)院， 陜西 延安 716000)

姜黃素對大鼠脊髓損傷后后肢功能恢復的作用機制*

郝 琴1， 王會偉1， 俞 茜2， 沈 娟1， 趙 琳1， 師芳芳1， 陳美霓1， 楊彥玲1△

(1. 延安大學醫(yī)學院， 2. 延安大學附屬醫(yī)院， 陜西 延安 716000)

目的觀察姜黃素(CUR)對大鼠脊髓損傷后的運動功能的影響，并探討其對大鼠脊髓損傷的神經(jīng)保護作用機制，為臨床治療脊髓損傷提供理論和實驗依據(jù)。方法采用 HI-0400 脊髓打擊器制備脊髓急性打擊損傷動物模型。將105只SD健康清潔級大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷組(SCI)、姜黃素組(SCI+CUR)，在脊髓損傷模型建立后30 min灌胃，以后每天灌胃1次，直到處死為止。SCI+CUR組0.5%羧甲基纖維素鈉制備姜黃素(100 mg/kg)灌胃，Sham組與SCI組同等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。應用BBB評分評估大鼠術(shù)后3 d，7 d，14 d，21 d和28 d后肢運動功能恢復的情況；分別在術(shù)后12 h、1 d、3 d和7 d天取脊髓組織和血液，通過免疫熒光法檢測NF-κB，免疫組化發(fā)檢測Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白，Elisa法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達。結(jié)果 ：BBB評分中3 d時SCI+CUR組與SCI組時無明顯差異，7 d、14 d、21 d和28 d SCI+CUR組得分高于SCI組，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；炎癥因子NF-κB的表達于脊髓損傷后12 h出現(xiàn)，1 d達高峰，3 d下降。SCI+CUR組中NF-κB在各個時間點的表達與SCI組出現(xiàn)的時間點相對應， SCI+CUR組少于SCI組；Sham組無明顯的Bax及Bcl-2蛋白染色。SCI+CUR組中Caspase-3及Bax染色明顯較SCI組減弱，而Bcl-2較SCI組增強。結(jié)論姜黃素可以促進大鼠脊髓損傷后后肢運動功能的恢復，其作用機制是通過抑制NF-κB而阻止炎癥發(fā)生；并通過抑制Bax、Caspase-3的表達，促進Bcl-2的表達來抑制細胞凋亡，從而促進了大鼠脊髓損傷后的運動功能恢復。

急性脊髓損傷；姜黃素；炎癥反應；細胞凋亡；大鼠

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重創(chuàng)傷，可以引起患者運動和感覺的障礙[1]，隨著經(jīng)濟、交通與建筑業(yè)的發(fā)展，其發(fā)病逐年上升，因高致殘率和高病死率一直成為醫(yī)學研究的熱門課題[2,3]。姜黃素(curcumin，CUR)是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種多酚復合物，有著廣泛的生物學作用，如抗氧化應激、抗炎癥、抗凋亡和抗腫瘤[4-6]等。近年研究表明姜黃素對心肌、腦、腎等臟器的缺血再灌注損傷具有保護作用[7-9]。此外，姜黃素在阿爾茨海默病、帕金森病、遲發(fā)性神經(jīng)功能運動障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也具有較顯著的神經(jīng)保護功能[10]。有研究表明，姜黃素可以促進大鼠脊髓損傷后后肢的運動功能恢復，其可能的作用機制如何尚不可知。本研究擬探討其可能的作用機制，為臨床的治療提供實驗室依據(jù)[11]。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

HI-0400脊髓打擊器(美國PSI公司)，超薄切片機(德國 Leica 公司)，顯微鏡和數(shù)碼攝像顯微圖像系統(tǒng) DP70 CK40-F200(Olymbus optical CO, LTD, Japan)，姜黃素(sigma公司)。Rabbit Anti-NFkBp65、 Mouse Anti-Caspase-3(P12) Rabbit Anti-BAX、Rabbit Anti-BCL-2、Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天)、兔抗體免疫組化試劑盒(博士德生物)。

1.2 實驗動物與分組

雌性成年SD大鼠105只，由西安交通大學動物實驗中心提供，體重200～220 g。在22℃～24℃進行飼養(yǎng)，保持空氣濕度50%～60%，自然光照，適當飲食用水，飼養(yǎng)1周后進行實驗。隨機分為3組(n=35)：假手術(shù)組(Sham組)，脊髓損傷組(SCI組)，脊髓損傷+姜黃素組(SCI+CUR組)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備脊髓損傷動物模型 術(shù)前8 h對大鼠禁食禁飲，按0.7 ml/100 g標準對每只大鼠予腹腔注射5%水合氯醛進行麻醉，選取T10為中心，取眼科剪，縱行將胸背側(cè)正中剪開，長度約2 cm，將脂肪墊剪掉，同時剪開深筋膜，使棘突凸顯，最后將兩側(cè)椎旁肌肉分離并“咬斷”，使得T9～T11椎板充分暴露，將T10棘突及椎板剔除，顯露脊髓節(jié)段，長度約1.0 cm。SCI+CUR組和SCI組采用美國PSI公司生產(chǎn)的HI-0400脊髓打擊器，打擊力量為200 kdyn/cm2建立脊髓損傷模型；sham組不予打擊，逐層縫合。模型成功的判定標準：打擊后，損傷處脊髓出血、水腫。大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀干回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。

1.3.2 給藥及護理 術(shù)后30 min開始給藥，以后每天給藥1次。SCI+Cur組0.5%羧甲基纖維素鈉制備姜黃素(100 mg/kg)灌胃；SCI組與sham組給予同等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉。皮下注射4萬單位青霉素鈉以及10 ml生理鹽水補充大鼠體液，每天2次，持續(xù)3 d。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，用電熱毯加熱保暖，大鼠飲水和進食不限，避免感染傷口。

1.3.3 灌流和取材 分別在各組大鼠術(shù)后12 h、1 d、3 d和7 d，各組取7只，致死量麻醉，心臟取血，心臟灌流取材，以損傷點為中心取脊髓組織3 cm。固定、脫水后石蠟包埋，切片后備用。

1.3.4 檢測方法 采用BBB(Basso，Beatlie，Bresnahan)評分法，對大鼠進行評分；按照免疫組化SABC法進行染色，DAB顯色，檢測炎癥因子NF-κB、促凋亡因子Bcl-2、抗調(diào)往因子Bax和Caspase 3蛋白表達。以PBS代替一抗作為陰性對照組。包漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達；采用Elisa法，嚴格按試劑盒內(nèi)步驟檢測大鼠血清中Bcl-2、Bax的含量。

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察

采用雙盲、雙人獨立觀察記錄在造模3 d、1周、2周、3周、4周后各組大鼠運動功能的評分，共5次。每只大鼠重復測試3次，最后取其均值(表1)。

Tab. 1 BBB score after SCI in rats (±s，n=7)

BBB: Basso，Beatlie，Bresnahan; SCI: Spinal cord injury； CUR: Curcumin

*P<0.05vsSCI group

2.2 免疫組化的改變

2.2.1 炎癥因子NF-κB的變化：假手術(shù)組中炎性因子無表達；脊髓損傷組中炎性因子的表達在12 h出現(xiàn)，1 d增多，3 d降低，而姜黃素處理組中，出現(xiàn)時間點與脊髓損傷組對應，對應的各個時間點炎性因子的的表達均降低(圖1)。

Fig.1Expression of NF-κB after SCI in rats(Cy3×40)

2.2.2 凋亡相關(guān)因子的變化 Sham組中無明顯的Bax及Bcl-2表達，Caspase-3的陽性表達少量或無表達；而在脊髓損傷組中，Bax的表達較姜黃素治療組升高， Bcl-2的表達較姜黃素治療組降低(圖2)。在脊髓損傷組中Caspase-3的表達較姜黃素治療組升高(表2，P<0.05)。Sham組促凋亡因子Bax與抗Bcl-2的表達不明顯；脊髓損傷組Bax的表達明顯增多，姜黃素組Bax的表達在各時間點均低于脊髓損傷組(表3)，而Bcl-2的表達則高于脊髓損傷組(P<0.05，表4)。

Fig.2Expression of Bax and Bcl-2 at 3 d after SCI in rats(SABC×40)

A: Bax Sham group; B: Bax SCI group; C: Bax SCI+CUR group; D: Bcl-2 Sham group; E: Bcl-2 SCI group; F: Bcl-2 SCI+CUR group)

Group12h1d3d7dSham3.33±1.263.43±1.593.35±1.483.45±1.51SCI25.10±5.1040.37±6.1852.97±4.8527.97±4.85SCI+CUR20.40±5.87*25.40±5.45*36.07±5.58*22.40±3.45*

SCI: Spinal cord injury; CUR: Curcumin

*P<0.05vsSCI group

Group12h1d3d 7d Sham0.001±0.0010.004±0.0010.002±0.0010.004±0.001SCI0.023±0.0020.038±0.0020.030±0.0030.027±0.002SCI+CUR0.028±0.005*0.054±0.004*0.049±0.007*0.055±0.008*

SCI: Spinal cord injury; CUR: Curcumin

*P<0.05vsSCI group

Group12h24h72h168hSham0.007±0.0020.015±0.0010.003±0.0020.026±0.002SCI1.356±0.0051.662±0.0071.776±0.0121.332±0.008SCI+CUR1.293±0.045*1.456±0.032*1.422±0.052*1.122±0.009*

SCI: Spinal cord injury; CUR: Curcumin

*P<0.05vsSCI group

3 討論

脊髓損傷發(fā)生以后，其原發(fā)性損傷只要是由于外力引起的，數(shù)小時后損傷的脊髓組織或鄰近部位發(fā)生一系列繼發(fā)性改變，包括炎癥、神經(jīng)細胞的凋亡、電解質(zhì)的改變等，其中凋亡被認為是脊髓繼發(fā)性損傷加重的關(guān)鍵原因[12,13]。炎癥在脊髓損傷的發(fā)病過程中起著重要作用，局部損傷組織的炎性反應可加重繼發(fā)性脊髓損傷的程度[14]，與原發(fā)性損傷不同的是，繼發(fā)性損傷可以通過后期的治療進行干預，使得脊髓損傷后的感覺、運動功能得以部分的恢復。目前臨床上對繼發(fā)性損傷的治療主要是藥物治療，因此選擇合適的治療藥物，抑制神經(jīng)細胞的炎性反應與繼發(fā)性凋亡并逆轉(zhuǎn)其功能是SCI后治療成功的關(guān)鍵。本實驗顯示：姜黃素可以通過抗炎、抗凋亡促進大鼠脊髓損傷后后肢功能的恢復。

NF-κB(nuclear factor-kappa B, NK-κB)主要產(chǎn)生于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，脊髓損傷時， NK-κB被激活，釋放大量的炎性細胞加重并誘導炎癥反應。本實驗過程中采用免疫組化染色法檢測大鼠SCI后不同時間點NF-κB活化情況以及使用CUR干預后各時間點NF-κB的變化情況。結(jié)果表明CUR可明顯抑制NF-κB的活化，其可能通過下調(diào)了核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性而抑制炎癥反應，進而發(fā)揮一定程度的神經(jīng)保護作用。

1996年，Li等[15]首先報道了在大鼠壓迫性脊髓損傷動物模型的脊髓組織白質(zhì)內(nèi)檢測出大量凋亡細胞。局部損傷后引起的繼發(fā)性炎性環(huán)境會促使損傷脊髓處的細胞發(fā)生壞死和凋亡 , 而出現(xiàn)不可逆性的病理改變,從而加重脊髓損傷[16]。 隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)Caspase-3參與、調(diào)控著細胞的死亡，在細胞的凋亡中起著重要的作用，因此Caspase-3被稱為死亡蛋白酶。Bcl-2、Bax被公認與凋亡的關(guān)系最為密切[17]，Bcl-2是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進程中呈較高表達水平的細胞質(zhì)蛋白，隨著神經(jīng)系統(tǒng)的逐漸完善，其表達水平維持在較低水平。Bcl-2作為抗凋亡基因, 能夠 促進軸索向外生長及損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織修復, 從而抑制脊髓損傷后出現(xiàn)的各種途徑的神經(jīng)細胞凋亡。本研究表明姜黃素對凋亡調(diào)控因子的表達起到了明顯的積極干預作用，通過提高Bcl-2表達，降低Bax表達，抑制細胞凋亡。Bcl-2、Bax的表達量在脊髓損傷后3～7 d達到峰值，然后下降，提示術(shù)后3～7 d是受損細胞凋亡的高峰。

綜上所述，姜黃素可以促進大鼠脊髓損傷的恢復，通過抑制炎癥因子NF-κB的表達來發(fā)揮神經(jīng)保護作用；通過降低Caspase-3、Bax的表達與促進Bcl-2的表達發(fā)揮抑制細胞凋亡的發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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Effectsofcurcuminontherecoveryofhindlimbfunctionafterspinalcordinjuryinratsanditsmechamism

HAO Qin1, WANG Hui-wei1, YU Qian2, SHEN Juan1, ZHAO Lin1, SHI Fang-fang1， CHEN Mei-mi， YANG Yan-ling1△

(1. Medical College of Yan'an University, 2. Affiliated Hospital of Yan'an University, Yanan 716000, China)

Objective: To investigate the effects of curcumin on motor function, and to explore the neuroprotective mechanism of curcumin after the spinal cord injury in rats. The study will theoretical and experimental evidence for curcumin’s clinical treatment.MethodsHI-0400 spinal cord impactor was used to prepare animal models of acute of spinal cord injury. One hundred and five clean and healthy rats were randomly divide into three groups: sham operation group (Sham) spinal cord injury group (SCI) and curcumin group (SCI+CUR). Intragastric administration was administrated after 30min of the spinal cord injury model, after 1 time a day, until the death. SCI+CUR group was intragastric administration with curcumin (100 mg/kg) of 0.5% carboxymethyl cellulose sodium, and Sham and SCI group were treated with the same dose of 0.5% carboxymethyl cellulose sodium. The motor function recovery of 3,7,14,21 and 28 days after spinal cord injury were evaluated by basso，beatlie，bresnahan (BBB) score. The spinal cord tissue and blood samples were collected at postoperative 12 h, 1 d, 3 d and 7 d respectively, NF- kappa B was detected by immunofluorescence, Bcl-2, Bax and Caspase-3 were detected by immunohistochemistry. The expression of Bcl-2 and Bax was detected by Elisa.ResultsThe statistic difference of BBB score between SCI group and CUR group in 3 day was not statistically significant. It was found that the 7,14,21 and 28 days BBB score in CUR group were statistically significant higher than that in SCI group(P<0.05) .The expression of inflammatory factor NF- kappa B appeared in 12 h after spinal cord injury, 1 day peaked and 3 days decreased. In SCI+CUR group, the expression of NF- kappa B at each time point was similar to the SCI group , and there was a difference between group SCI+CUR and SCI group in 1day .There was no obvious staining of Bax and Bcl-2 in Sham group . The staining of Caspase-3 and Bax in SCI+CUR group was significantly weaker than that in SCI group, while Bcl-2 was stronger.ConclusionCurcumin can promote the recovery of hindlimb motor function after spinal cord injury in rats.The mechanism is through inhibition of NF- K B to prevent inflammation; And inhibition the expression of Bax and Caspase-3, and promotion the expression of Bcl-2 to prevent apoptosis, so as to accelerate the recovery of motor function in the rats after spinal cord injury.

acute spinal cord injury; curcumin; action of the hind limb; inflammatory response; apoptosis; rats

R683

A

1000-6834(2017)05-441-04

10.12047/j.cjap.5548.2017.106

國科自然科學基金委應急管理項目項目(81650022，81641048)；陜西省科技廳項目(2013K12-01-23)；延安大學校級課題(YDK2015-78)

2017-01-05

2017-07-04

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Tel： 13891184889； E-mail： yangyanling8889@163.com