王 倩， 別玉龍， 王 豆， 范文濤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 咸陽 712046)

蒲公英多糖對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6/STAT3信號通路的影響*

王 倩， 別玉龍， 王 豆， 范文濤△

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 咸陽 712046)

目的觀察蒲公英多糖對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型IL-6/STAT3信號通路的調(diào)控作用。方法清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組(n=10)：空白組、模型組、陽性對照組、蒲公英多糖組。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型，陽性對照組采用美沙拉嗪10 mg/kg·d灌胃，蒲公英多糖組采用蒲公英多糖10 mg/kg·d灌胃，治療4周后處死，觀察大鼠結(jié)腸粘膜病理改變，檢測大鼠血清白介素-6(IL-6)含量、結(jié)腸髓過氧化物酶(MPO)、白介素-6受體(sIL-6Rα)、糖蛋白130(gp130)、轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、IL-6 mRNA表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6含量明顯升高(P<0.01)，MPO陽性密度明顯增高(P<0.01)，sIL-6Rα、gp130含量明顯增高(P<0.01)，腸組織STAT3、IL-6 mRNA相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較蒲公英多糖組、美沙拉嗪組大鼠血清IL-6含量明顯降低(P<0.01)，MPO陽性密度明顯降低(P<0.01)，sIL-6Rα、gp130含量明顯降低(P<0.01)，腸組織STAT3、IL-6 mRNA相對表達(dá)量與模型組比較明顯降低(P<0.05)。結(jié)論蒲公英多糖能夠降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6水平，下調(diào)IL-6/STAT3通路中sIL-6Rα、gp130蛋白表達(dá)量，進(jìn)而下調(diào)大鼠腸組織STAT3、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，緩解結(jié)腸組織的炎癥狀態(tài)，保護(hù)和修復(fù)粘膜組織，起到治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

蒲公英多糖；炎癥性腸??；大鼠模型；IL-6/STAT3信號通路

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)是腸道發(fā)病原因不明確的疑難病之一，由于炎癥在腸道頻繁發(fā)作，且病情纏綿難愈，UC患者病程在25個月以上的腫瘤發(fā)生率可高達(dá)40%，故結(jié)直腸癌已成為UC的致命性并發(fā)癥之一[1]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蒲公英多糖能夠通過抑制COX2，IL-1β及IL-6 mRNA的表達(dá)控制炎癥進(jìn)展，以上三種炎性因子中IL-6/STAT3信號通路與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病密切相關(guān)[2]。本文通過采用蒲公英多糖對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，監(jiān)測IL-6/STAT3信號通路中sIL-6Rα、gp130關(guān)鍵蛋白及STAT3、IL-6 mRNA相對表達(dá)量的變化，為闡明蒲公英多糖基于IL-6/STAT3蛋白通路治療炎癥性腸病藥效作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)和新認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

美沙拉嗪緩釋顆粒劑(法國愛的發(fā)制藥技術(shù)公司，批號：20140205)IL-6 放免藥盒(上海瑞齊生物科技有限公司)Maxvisiontm即用型試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS)(Sigma公司)MPO及NF-κB單克隆抗體(上海倍卓生物科技有限公司)IL-6/STAT3 試劑盒(上海研鑫生物科技有限公司)sIL-6Rα/gp130 ELISA試盒(上海滬宇生物科技有限公司)。

1.2 制備蒲公英多糖

蒲公英多糖：取蒲公英干品回流提取、離心，沉淀部分用無水乙醇脫水2次，返溶凍干，凍干品為粗多糖。取粗多糖溶于超濾水中，濾液過柱，洗脫液經(jīng)8 KD 膜包超濾，收集循環(huán)液，凍干為總多糖。同時收集透過液，濃縮凍干，為小分子對照品。檢測：本品為無定形粉末，不溶于高濃度的乙醇和丙酮，Molish反應(yīng)和蒽酮硫酸反應(yīng)陽性，證明該粉末中含多糖；本品用蒽酮—硫酸比色法檢測多糖含量，其多糖含量為82%～93%；取本品1%水溶液1 ml，加新配制的30%磺基水楊酸試液1 ml，混合放置5 min，結(jié)果未檢出蛋白質(zhì)。

1.3 動物分組、造模及給藥

清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，動物購買于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重190±20 g，許可證號：SCXK(陜)2015-232。實(shí)驗(yàn)前置清潔級環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周( 室溫20℃～25℃，常規(guī)食水，12 h 晝夜交替)。大鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：即空白組(normal) ，模型組(model)，陽性對照組(美沙拉嗪組, Mesalazine)，蒲公英多糖組(dandelion polysaccharide，DP)。TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠模型：大鼠空腹24 h后，麻醉將30 mg TNBS加入0.3 ml 40%無水乙醇中，注入大鼠結(jié)腸。待藥物被腸道充分吸收后，將大鼠放回籠子，自由飲水和飲食?？瞻讓φ战M大鼠僅注入相應(yīng)體積的0.9% NaCl溶液灌腸，其他條件和模型組相同。

給藥：模型復(fù)制成功后，從造模的第3天開始灌胃給藥，蒲公英多糖組給予蒲公英多糖，每次10 mg/kg·d，持續(xù)1周；美沙拉嗪組劑量為每次10 mg/kg·d，持續(xù)1周；模型組的大鼠給予等量生理鹽水灌胃每日1次，持續(xù)1周，正常對照組，等量生理鹽水灌胃每日1次，所有動物1周后處死。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 病理切片制作及組織病理學(xué)評分 將在10%的福爾馬林中固定24 h 以上的結(jié)腸組織做病理切片，HE染色，光鏡下觀察潰瘍情況。

1.4.2 放射免疫檢測血清IL-6含量 取大鼠靜脈血分離血清，按照試劑盒說明書具體操作，完全混勻后，在室溫中放置15 min，然后4℃下離心機(jī)(3 200 r/min)共離心15 min，除去上層清液后檢測各個管中沉淀物放射性計(jì)數(shù)(cpm)。

1.4.3 免疫組化染色法測定結(jié)腸MPO 快捷免疫組化染色法(Max vision， TM)測定結(jié)腸髓過氧化酶(myeloperoxidase，MPO)，具體實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書。

1.4.4 酶聯(lián)免疫分析法檢測sIL-6Rα、gp130 TM測定結(jié)腸白介素-6受體(interleukin-6 receptor，sIL-6Rα)、糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)，具體實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書。

1.4.5 RT-PCR方法檢測STAT3、IL-6 mRNA： 操作步驟如下：按照 TRIzol試劑說明書提取各組結(jié)腸組織中的總RNA; 按照 RT-PCR試劑盒說明書，以O(shè)ligo (dT) 為引物將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件: 95℃ 5 min，30℃ 10 min，42℃ 60 min，以β-actin 作為內(nèi)參。實(shí)時熒光定量PCR檢測STAT3，IL-6 mRNA的表達(dá)量。相關(guān)的引物序列如下: β-actin的引物序列:(forward)5 '-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3'，(reverse)5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3'，產(chǎn)物大小217 bp; STAT3引 物 序 列5'-ATCTAAAAAGAGACCGAGGTGTATCACCAGAGAACTTGGTGATACACCTCG GTCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA-3'(reverse)5'-ATCTAAAAAGTGAGCAATACGCGCCTAGAGAGAACTTCTAGGCGCGTATTGCTCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA-3，產(chǎn)物大小390 bp; IL-6引物序列: (forward) 5'-AGCCCACCAGGAACGAAAG-3'(reverse)5'-GGAAGGCAGTGGCTGTCAA-3'，產(chǎn)物大小332 bp。擴(kuò)增條件94℃ 4 min; 94℃ 20 s;60℃ 30 s;72℃ 30 s循環(huán)35次，72℃檢測信號。PCR儀讀出各組 STAT3，IL-6內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(cyclethreshold，Ct);采用相對定量法(2-ΔΔCt)求得各樣本STAT3，IL-6mRNA的ΔCt值(ΔΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因 Ct)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸粘膜的大體變化

正常對照組大鼠的結(jié)腸粘膜未見任何病變，表面光滑，紋理清晰。模型組大鼠病變處腸組織顯著增厚，粘膜表現(xiàn)充血伴有水腫、糜爛及潰瘍。模型組、美沙拉嗪治療組、蒲公英多糖組大鼠的腸壁就增厚程度、粘膜充血水腫及糜爛、潰瘍等情況均較模型組有所減輕，其中蒲公英多糖組改善最顯著。

2.2 大鼠結(jié)腸組織的病理改變

各組大鼠結(jié)腸組織經(jīng)HE染色后，正常對照組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列整齊，粘膜上皮細(xì)胞完整。模型組大鼠腸組織紋理嚴(yán)重紊亂，多量腺體遭到破壞，大量炎癥細(xì)胞出現(xiàn)，粘膜層表現(xiàn)糜爛。美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，部分腺體遭到破壞，出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞，粘膜層出現(xiàn)糜爛。蒲公英多糖組直腸組織出現(xiàn)較少的炎癥細(xì)胞，組織水腫較輕，少量腺體破壞，部分粘膜表面糜爛(圖1)。

Fig.1Pathological changes of colon tissues in rats(HE ×200)

DP: Dandelion polysaccharide

2.3蒲公英多糖對大鼠血清IL-6含量及結(jié)腸組織MPO的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6含量明顯升高(P<0.01)，MPO陽性密度明顯增高(P<0.01)；與模型組比較蒲公英多糖組、美沙拉嗪組大鼠血清IL-6含量明顯降低(P<0.01)，MPO陽性密度較明顯降低(P<0.01，表1)。

GroupIL-6(pg/ml)MPO(u)Normal88.66±2.0216.40±1.86Model292.17±7.05**34.92±2.28**DP87.54±2.59##17.16±1.70##Mesalazine151.92±2.98##25.48±0.86##

DP: Dandelion polysaccharide; IL-6: Interleukin-6; MPO: Myeloperoxidase

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

2.4蒲公英多糖對大鼠血清sIL-6Rα、gp130含量的影響

與正常組比較模型組大鼠sIL-6Rα、gp130含量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較蒲公英多糖組、美沙拉嗪組大鼠sIL-6Rα、gp130含量明顯降低(P<0.01，表2、圖2)。

GroupsIL-6Rαgp130Normal13.93±1.65317.56±18.08Model85.22±1.93**508.67±19.37**DP21.89±2.65##327.86±21.79##Mesalazine30.36±1.61##377.30±10.42##

DP: Dandelion polysaccharide; sIL-6Rα: Interleukin-6 receptor-α; gp130: Glycoprotein 130

**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group

Fig.2Levels of sIL-6Rα in colon tissues(immunohistochemical ×400)

2.5蒲公英多糖對大鼠結(jié)腸組織STAT3、IL-6mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較模型組大鼠腸組織STAT3、IL-6 mRNA相對表達(dá)量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較蒲公英多糖組、美沙拉嗪組大鼠腸組織STAT3、IL-6 mRNA相對表達(dá)量與模型組比較明顯降低(P<0.05，表3)。

GroupSTAT3/β-actinIL-6mRNA/β-actinNormal1.82±0.7912.95±1.51Model5.04±0.43**64.56±2.27**DP1.87±0.09#18.09±1.06#Mesalazine2.59±0.29#28.42±0.74#

DP: Dandelion polysaccharide; STAT3: Transcriptional activator3; IL-6: Interleukin-6

**P<0.01vsnormal group，#P<0.05vsmodel group

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)慢性結(jié)腸炎患者體內(nèi)IL-6含量明顯升高，炎癥部位也發(fā)現(xiàn)了高濃度的IL-6[3]，通過循證醫(yī)學(xué)研究進(jìn)一步明確了IL-6與炎癥的關(guān)系[4]。IL-6主要調(diào)節(jié)腸道腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮因子，促進(jìn)其增殖，其結(jié)合可溶性IL-6受體(soluble interleukin-6 receptor，sIL-6R) 形成IL-6/SIL-6R復(fù)合物，繼而活化細(xì)胞膜表面的gpl30，誘導(dǎo)STAT3轉(zhuǎn)錄因子活化促進(jìn)炎癥進(jìn)展[5]，甚至誘導(dǎo)炎癥局部發(fā)生惡性病變[6]。大量研究發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的腫瘤中 IL-6及其受體 (IL-6R) 呈高表達(dá)，且這些腫瘤患者的血清中IL-6升高與患者臨床預(yù)后不良密切相關(guān)[7]。因此這一信號通路為我們研究蒲公英多糖治療炎癥性腸病防止惡變的具體機(jī)制提供新的思路。

蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，其中含有蒲公英多糖、蒲公英醇、蒲公英素、膽堿、有機(jī)酸、菊糖等多種活性成份。實(shí)驗(yàn)表明蒲公英多糖能夠顯著抑制炎性動物模型體內(nèi)COX2，IL-1β及IL-6 mRNA的表達(dá)[2]，而被廣泛用于急慢性炎癥相關(guān)研究。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過監(jiān)測蒲公英多糖對大鼠結(jié)腸炎動物模型體內(nèi)IL-6/STAT3信號通路中相關(guān)調(diào)節(jié)因子水平變化，進(jìn)一步明確了蒲公英多糖能夠有效降低IL-6、sIL-6Rα及gp130水平，調(diào)節(jié)血清sIL-6Rα、gp130蛋白表達(dá)水平進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)和修復(fù)粘膜組織，起到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究通過干預(yù)IL-6/STAT3信號通路起到抑制慢性潰瘍性結(jié)腸炎患者炎癥進(jìn)展進(jìn)一步降低腫瘤的發(fā)生率提供了新的研究思路。

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EffectsofDandelionpolysaccharideonIL-6/STAT3signalingpathwayinulcerativecolitisrats

WANG Qian, BIE Yu-long， WANG Dou, FAN Wen-tao△

(Shanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Objective: To investigate the effects of dandelion polysaccharide on IL-6/STAT3 signaling pathway in rats with ulcerative colitis.MethodsForty SD rats were randomly divided into four groups (n=10): control group, model group, positive control group and dandelion polysaccharide group. The ulcerative colitis model was established by treated with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). The positive control group was treated with mesalazine 10 mg/kg·d and dandelion polysaccharide group was treated with dandelion polysaccharide 10 mg/kg·d. The levels of interleukin -6(IL-6), colonic myeloperoxidase (MPO) and interleukin-6 receptor (sIL-6Rα) were measured after 4 weeks of treatment. The pathological changes of colonic mucosa were observed in rats. The gene expressions of glycoprotein 130 (gp130), transcriptional activator3(STAT3) and IL-6 were detected.ResultsCompared with the normal control group, the level of serum IL-6 in the model group was significantly higher than that in the control group (P<0.01). Compared with the model group, the serum levels of IL-6 in the dandelion polysaccharide group and the methacetin group were significantly decreased (P<0.01). Compared with the model group, the MPO positive density of the rats in the dandelion polysaccharide group and the methacetin group was significantly lower than that in the normal group (P<0.01). Compared with the model group, the levels of sIL-6Rα and gp130 in the rats were significantly lower than those in the model group (P<0.01). Compared with the model group, the expressions of STAT3 and IL-6 mRNA in the intestinal tissue of the rats in the dandelion polysaccharide group and the methacetin group were decreased significantly.ConclusionDandelion polysaccharide can decrease the level of IL-6 in rats with ulcerative colitis, regulate the expression of sIL-6Rα and gp130 protein in IL-6/STAT3 pathway, and then down-regulate the expressions of STAT3 and IL-6 mRNA in intestinal tissue of rats, alleviate the colon inflammation state, protect and repair the mucosal tissue. Dandelion polysaccharide plays a role in the treatment of ulcerative colitis.

dandelion polysaccharide； inflammatory bowel disease； rat model； IL-6/STAT3 signaling pathway； regulation

R966

A

1000-6834(2017)05-422-04

10.12047/j.cjap.5525.2017.102

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202847，81470188，81673832)；陜西省教育廳項(xiàng)目(14JK1197)；陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(13-LC073)

2016-11-21

2017-06-21

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Tel: 029-38185297； E-mail: 1404113637@qq.com