楊志軍， 鄧 毅△， 曼 瓊， 王 勇， 楊秀娟， 趙 妮， 劉 靚

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室， 2. 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 蘭州 730000)

甘草內(nèi)生菌發(fā)酵物對(duì)痰濁阻肺大鼠炎癥相關(guān)因子、水通道蛋白的影響*

楊志軍1， 鄧 毅1△， 曼 瓊1， 王 勇2， 楊秀娟1， 趙 妮1， 劉 靚2

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室， 2. 教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 蘭州 730000)

目的篩選具有祛痰作用的甘草內(nèi)生菌菌株發(fā)酵物。方法Wistar大鼠90只，雌雄各半，隨機(jī)分為9組(n=10)：即空白組、模型組、陽性對(duì)照組、甘草水煎液組、甘草內(nèi)生菌發(fā)酵物5組(JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063)。采用SO2煙薰30 min、低溫兼冷風(fēng)刺激10 min誘導(dǎo)痰濁阻肺大鼠模型，每天2次，連續(xù)10 d。造模10 d后，空白組、模型組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，陽性組給予復(fù)方貝母氯化銨片0.08 g/kg灌胃，水煎液組給予甘草水煎液0.95 g/kg，內(nèi)生菌各組給予甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液蒸干粉末0.95 g/kg，每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，觀察大鼠一般情況。第7天，灌胃給藥2 h后，斷頸處死大鼠，取右肺上葉，4%戊二醛固定，HE染色切片，光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組化染色切片，檢測(cè)水通道蛋白1、5(AQP1、AQP5)的分布及表達(dá)。硝酸還原酶法測(cè)定肺組織一氧化氮(NO)含量，ELISA檢測(cè)大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的含量及環(huán)氧化酶-2(COX-2)的濃度。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠肺組織中NO、TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度顯著升高，而水通道蛋白AQP1、AQP5的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，水煎液組、JTZB005、JTZB006、JTZB063組肺組織NO、TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度均顯著降低，AQP1、AQP5的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論篩選出JTZB005、JTZB006、JTZB063等3株具有祛痰作用的甘草內(nèi)生菌有效菌株。

甘草內(nèi)生菌；祛痰；大鼠；炎癥因子；水通道蛋白

近年來，為了拓寬藥用植物資源，尋找有效的替代品，對(duì)藥用植物內(nèi)生菌的研究取得了一定進(jìn)展。研究證實(shí)，內(nèi)生菌與宿主植物在長(zhǎng)期共生的過程中，可獲得宿主植物的部分基因，產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)[1，2]。甘草能祛痰止咳，善治咳嗽有痰之癥，但甘草內(nèi)生菌的體內(nèi)藥效學(xué)報(bào)道鮮見。本課題通過研究甘草內(nèi)生菌對(duì)痰濁阻肺模型大鼠肺組織形態(tài)、炎癥相關(guān)因子、水通道蛋白(AQP1、AQP5)表達(dá)的影響，篩選出具有祛痰作用的甘草內(nèi)生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 3月齡Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002)。自由攝食、飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料；飼養(yǎng)溫度：20℃～24℃，相對(duì)濕度：40%～50%。

1.1.2 受試藥物 甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液的制備：前期體外抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出5株甘草內(nèi)生菌有效菌株，分別為：JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063。經(jīng)鑒定，以上5株均為甘草內(nèi)生細(xì)菌。在250 ml錐形瓶中加入100 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NA)，分裝5瓶，121℃滅菌20 min。在雙人凈化工作臺(tái)上用接種環(huán)分別挑取10環(huán)活化的JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063菌種，接種于滅菌的NA培養(yǎng)基中，放置于搖床，在25℃、200 r/min條件下培養(yǎng)4d，最后將發(fā)酵液在4℃、3 000 r/min離心15 min，過濾上清液，60℃烘干備用。采用紫外分光光度法檢測(cè)，甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液干燥粉末中均含有總黃酮、總皂苷。甘草水提液的制備：11月初在甘肅省金塔縣采集栽培的烏拉爾甘草，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)中心高級(jí)實(shí)驗(yàn)師林麗鑒定為3年生甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。將甘草洗凈，切厚片，將適量蜂蜜用開水稀釋后，淋入甘草片中拌勻悶潤(rùn)，文火加熱，炒至黃色、不粘手時(shí)，取出晾涼，即為炙甘草。取適量炙甘草，加10倍量水，煎煮40 min，過濾，再加8倍量水，煎煮30 min，過濾，合并兩次濾液，水浴濃縮至含生藥45 mg/ml的濃縮液，高壓滅菌，4℃儲(chǔ)存。復(fù)方貝母氯化銨片，西安利君制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)1506390。

1.1.3 主要試劑與儀器 一氧化氮(NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20160308；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor ，TNF-α)ELISA試劑盒，欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：R160506-102a；細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1或CD54)ELISA試劑盒，批號(hào)：AK0016MAY 05001，還氧化酶-2(cyclooxygenase -2，COX-2)ELISA試劑盒，批號(hào)：AK0016MAY05002，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；兔抗大鼠水通道蛋白-1(aquaporins-1，AQP1)，批號(hào)：bS-1506R，兔抗大鼠水通道蛋白-5(AQP5)，批號(hào)：bS-1554R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

HJ-CJ-2D雙人凈化工作臺(tái)，上海蘇靜實(shí)業(yè)有限公司；DHP-927電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GFL3033型氣浴恒溫?fù)u床，北京博勵(lì)行儀器公司；MODEL680-酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模、給藥 Wistar大鼠90只，隨機(jī)分為9組(n=10)：空白組、模型組、陽性對(duì)照組、甘草水提液組、甘草內(nèi)生菌各組(JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063)。根據(jù)參考文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)建立痰濁阻肺大鼠模型[3]?？瞻捉M大鼠置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)，其余各組大鼠采用SO2煙薰30 min(將3 g 硫磺粉均勻?yàn)⒉加谇灏瑮l中點(diǎn)燃)，再放置于人工氣候箱中，10℃并冷風(fēng)刺激10 min，每天2次，連續(xù)10 d。第11天，空白組、模型組均給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，陽性組給予復(fù)方貝母氯化銨片0.08 g/kg灌胃，水煎液組給予甘草水煎液0.95 g/kg，甘草內(nèi)生菌各組給予甘草內(nèi)生菌發(fā)酵液蒸干粉末0.95 g/kg。各組藥物均用蒸餾水稀釋，與空白組等容積灌胃，1 count/d，連續(xù)7 d。第7天，灌胃給藥2 h后，斷頸處死大鼠，取右肺上葉，4%戊二醛固定。取右肺中葉肺組織，準(zhǔn)確稱取，加入生理鹽水，冰浴下按兩者重量體積比制成10%的肺組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.2 證候?qū)W觀察 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，活動(dòng)，進(jìn)食量，口鼻分泌物，呼吸狀況等癥狀、體征。

1.2.3 肺組織形態(tài)學(xué) HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 肺組織炎癥相關(guān)因子含量測(cè)定 取上清液，硝酸還原酶化學(xué)比色法測(cè)定NO含量，嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度。

1.2.5 水通道蛋白AQP1、AQP5的分布及表達(dá) 免疫組化染色切片，在光學(xué)顯微鏡下選擇陽性細(xì)胞(棕黃色顆粒)較多的區(qū)域采集5個(gè)光鏡視野，拍照，并輸入到成都泰盟BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，用灰度值代表染色強(qiáng)度表達(dá)，在統(tǒng)一的背底、倍數(shù)條件下以灰度均值為參數(shù)，計(jì)算機(jī)定量檢測(cè)AQP1、AQP5在肺組織的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 證候?qū)W變化

空白組大鼠反應(yīng)靈活，呼吸自如，食欲旺盛，毛發(fā)光澤，體重持續(xù)上升。模型組大鼠普遍食少，消瘦，毛發(fā)枯槁，精神倦怠，可聞及明顯的痰鳴音，呼吸喘促，時(shí)有咳嗽，口鼻分泌物增多。各藥物組大鼠飲食基本正常，皮毛較有光澤，較活潑，體重緩慢增加，痰鳴音逐漸減輕，偶有咳嗽。

2.2 各組大鼠肺組織形態(tài)變化

空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯擴(kuò)張，支氣管粘膜上皮完整，管壁未增厚，管腔內(nèi)纖毛排列整齊，無明顯的炎性滲出。模型組大鼠肺泡壁變薄，部分?jǐn)嗔眩闻萸辉龃?，個(gè)別肺泡融合成肺大泡，肺間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞，支氣管粘膜上皮脫落，不完整，纖毛缺失，管壁增厚，杯狀細(xì)胞增多，粘膜層及粘膜下層有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性組、水煎液組、JTZB005、JTZB006、JTZB063組均可見支氣管上皮較完整，支氣管管壁略增厚，纖毛較模型組多，粘膜下及間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組輕，肺泡腔輕度擴(kuò)大。JTZB043、JTZB060組與模型組所見基本一致(圖1)。

Fig.1Pathologic morphology in lung tissues(HE×100)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positive control group; D: Glycyrrhiza decoction group; E: JTZB005 group; F: JTZB006 group: G: JTZB043 group; H: JTZB060 group; I: JTZB063 group

2.3各組藥物對(duì)大鼠肺組織中炎癥相關(guān)因子的影響

與空白組比較，模型組大鼠肺組織中NO、TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組、水煎液組、JTZB005、JTZB006、JTZB063組NO含量顯著降低，除JTZB043組，其余各藥物組TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度均顯著降低(P<0.05,P<0.01)；藥物組間比較，JTZB043組各指標(biāo)、JTZB060組TNF-α的含量、COX-2的濃度均顯著高于水煎液組(P<0.05，P<0.01，表1)。

Tab. 1 Levels of inflammation-associated factors in lung tissue(±s，n=10)

NO： Nitric oxide； TNF-α： Tumor necrosis factor-α； ICAM-1： Intercellular adhesion molecule 1； COX-2： Cyclooxygenase-2

**P<0.01vsnomal control group；#P<0.05，##P<0.01vsmodel group；△P<0.05，△△P<0.01vsglycyrrhiza decoction group

2.4各組大鼠水通道蛋白AQP1、AQP5的分布與表達(dá)

與空白組比較，模型組AQP1 、AQP5的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，陽性組、水煎液組、JTZB005組、JTZB006組、JTZB063組AQP1 、AQP5的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；藥物組間比較，JTZB043、JTZB060組AQP5陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于水煎液組(P<0.05,圖2、圖3，表2)。

Fig.2Distribution and expression of aquaporin 1(AQP1)in lung(SP ×400)

A： Normal control group; B. Model group; C: Positive control group; D: Glycyrrhiza decoction group; E: JTZB005 group; F: JTZB006 group; G: JTZB043 group; H: JTZB060 group; I: JTZB063 group

Fig.3Distribution and expression of aquaporin 5(AQP5)in lung(SP ×400)

A: Normal control group; B: Model group; C: Positive control group; D: Glycyrrhiza decoction group; E: JTZB005 group; F: JTZB006 group; G: JTZB043 group; H: JTZB060 group; I: JTZB063 group

GroupDosage(g/kg)AQP1AQP5Nomalcontrol—145.40±26.84150.35±30.58Model—95.27±23.85**96.44±25.20**Positivecontrol0.08128.74±32.10#130.28±22.43#Glycyrrhizadecoction0.95118.50±20.30#126.80±26.35#JTZB0050.95120.36±23.52#124.66±30.26#JTZB0060.95123.04±24.88#128.30±31.78#JTZB0430.95100.08±33.4599.28±28.64△JTZB0600.95105.89±30.4196.05±28.35△JTZB0630.95124.58±22.75#129.62±25.44#

AQP： Aquaporin

**P<0.01vsnomal control group；#P<0.05vsmodel group；△P<0.05vsglycyrrhiza decoction group

3 討論

植物內(nèi)生菌是寶貴的微生物資源，是存在于活體植物健康組織或細(xì)胞內(nèi)并且不引起宿主植物組織發(fā)病的一類微生物群，包括內(nèi)生真菌、細(xì)菌、放線菌。目前，諸多研究者已從甘草根、莖、葉中分離出不同種屬的甘草內(nèi)生菌[4,5]。

本課題對(duì)栽培烏拉爾甘草中分離出的5株甘草內(nèi)生菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，JTZB005、JTZB060屬于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，JTZB006屬于萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)，JTZB043屬于漠海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)，JTZB063屬于索諾拉沙漠芽孢桿菌(Bacillussonorensis)，且同源性均為100%。張敏等[6]研究證實(shí)，甘草內(nèi)生細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌屬，與本鑒定結(jié)果一致。

痰濁阻肺多由風(fēng)寒邪氣外侵，導(dǎo)致肺的宣降功能失常，繼而輸布津液失司，導(dǎo)致水液停滯，聚而成痰。因此，本課題采用低溫兼冷風(fēng)刺激結(jié)合SO2煙薰誘導(dǎo)痰濁阻肺大鼠模型。結(jié)果顯示：模型組大鼠普遍出現(xiàn)呼吸喘促，可聞及咳嗽、氣道痰鳴音，且口鼻分泌物增多。模型組病理切片可見支氣管管壁增厚、杯狀細(xì)胞增多、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管粘膜上皮不完整、脫落、肺泡壁變薄、肺泡腔增大等變化，表明模型復(fù)制成功。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，中醫(yī)學(xué)“痰證”是機(jī)體在有害因素的作用下，上呼吸道或肺部炎癥的表現(xiàn)，與機(jī)體細(xì)胞因子的表達(dá)水平密切相關(guān)[7]。一氧化氮(NO)是機(jī)體巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等被激活釋放的炎癥介質(zhì)，NO能引起血管擴(kuò)張，氣道充血，導(dǎo)致氣道的炎癥和水腫，高濃度NO有細(xì)胞毒作用，造成氣道組織壞死脫落，氣道炎癥損害加劇。同時(shí)，NO能促進(jìn)肺部巨噬細(xì)胞等釋放TNF-α、IL-1等大量炎癥介質(zhì)[8]。TNF-α誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞及炎性細(xì)胞活化，產(chǎn)生多種致?lián)p物質(zhì)，并能直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，增高內(nèi)皮細(xì)胞通透性，還可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1等多種粘附分子，刺激單核-巨噬細(xì)胞聚集，分泌趨化性細(xì)胞因子等[9]，TNF-α釋放過多時(shí)，會(huì)引起肺部一系列炎性損害。ICAM-1通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞活化，并使白細(xì)胞、炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強(qiáng)，促進(jìn)白細(xì)胞從血管內(nèi)向炎癥部位浸潤(rùn)，參與炎癥[10]。肺部炎癥時(shí)，NO、TNF-α、ICAM-1等含量升高，這些因子作為誘導(dǎo)劑，導(dǎo)致COX-2表達(dá)水平上調(diào)，其將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，增加血管滲透性、促進(jìn)單核細(xì)胞粘附、刺激炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生等，從而導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng)[11]。結(jié)果顯示：JTZB005、JTZB006、JTZB063組大鼠肺組織NO、TNF-α、ICAM-1的含量及COX-2的濃度均顯著降低，表明甘草內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵物能通過抑制炎癥相關(guān)因子活性，從而減少呼吸道黏液分泌發(fā)揮祛痰作用。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“痰”為機(jī)體水液代謝異常的病理產(chǎn)物。在肺組織，肺泡內(nèi)液體的轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩種方式：一是伴隨Na+的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，二是經(jīng)肺泡上皮的水通道。水通道蛋白(AQPs)是一組介導(dǎo)水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜糖蛋白家族，在調(diào)控水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及維持水液代謝平衡等方面發(fā)揮作用，可實(shí)現(xiàn)水液在不同滲透壓梯度間的轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。AQP1主要分布在細(xì)支氣管和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，可以清除支氣管和微血管周圍的液體，而AQP5主要分布在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，能清除肺泡腔內(nèi)液體[13]。AQP的表達(dá)水平受炎性細(xì)胞因子和其他多種因素的調(diào)節(jié)，林陽生等研究證實(shí)急性冷暴露后AQP-5的基因和蛋白表達(dá)顯著降低[14]。AQP1及AQP5的異常表達(dá)與肺組織水液代謝失衡、氣道黏液高分泌等有密切聯(lián)系[15]。結(jié)果顯示，JTZB005、JTZB006、JTZB063組大鼠肺組織AQP1 、AQP5的表達(dá)水平顯著升高，表明甘草內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵物能增強(qiáng)水通道蛋白AQP1 、AQP5的表達(dá)，改善肺組織水液代謝，發(fā)揮祛痰作用。

綜上所述，篩選出JTZB005、JTZB006、JTZB063等3株具有祛痰作用的甘草內(nèi)生菌。

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EffectsofthefermentationproductsofendophytesfromGlycyrrhizauralensisoninflammation-associatedfactorsandAquaporininratmodelswithphlegmblockinginlung

YANG Zhi-jun1， DENG Yi1△， MAN Qiong1， WANG Yong2， YANG Xiu-juan1， ZHAO Ni1， LIU Liang2

(1. Traditonal Chinese Pharmacology Teaching Research Section, Gansu University of Chinese Medicine,2. The Experimental Teaching Center, Lanzhou 30000, China)

Objective: To filtrate the effective fermentation products of endophytes from Glycyrrhiza uralensis by comparing expectorant effects.MethodsNinety Wistar rats with half males and half females were randomly divided into 9 groups(n=10): including normal control group, model group, positive control group, Glycyrrhiza decoction group, 5 groups of the fermentation products of endophytes(JTZB005，JTZB006，JTZB043，JTZB060，JTZB063). The model of phlegm blocking in lung was induced by inhaling SO2for 30 minutes and cold wind for 10 minutes twice per day for ten days. Ten days later, 10 ml/kg normal saline was administrated in normal control group and model group, 0.08 mg/kg Fufang Beimu Lvhuaan tablets was administrated in positive control group, 0.95 g/kg Glycyrrhiza water decoction and the fermentation products of endophytes were respectively administrated in Glycyrrhiza decoction group and 5 groups of the fermentation products of endophytes. All groups were given the corresponding dose by intragastric administration once a day for seven days. The changes of rats’ general activities were observed during the experimental time. Two hours after the last gavage, rats were sacrificed. The upper lobe of the right lung was removed for HE and immunohistochemical staining. Pathological of lung tissues and the expressions of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-5(AQP5) in lung tissue were measured. In addition, the lung tissue of middle lobe of right lung were accurately weighed, and 10% homogenate were made. The supernatant was removed by centrifugation at 3 000 r/min for ten minutes. The levels of nitric oxide (NO) was determined by nitric acid reductase method. The content of tumor necrosis factor(TNF-α) and intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1) and the concentration of cyclooxygenase-2(COX-2) in lung tissue were measured by enzyme-linked immunosorbent(ELISA) method.ResultsAfter modeling，the levels of NO, TNF-α, ICAM-1, and the concentration of COX-2 in lung tissue were increased significantly, the expressions of AQP1 and AQP5 were decreased significantly (P<0.01) . Compared with the model group, the levels of NO,TNF-α,ICAM-1 and the concentration of COX-2 in lung tissue were decreased significantly, and the expressions of AQP1 and AQP5 were increased significantly in Glycyrrhiza decoction group, JTZB005,JTZB006 and JTZB063 group(P<0.05,P<0.01).ConclusionBy filtrating, JTZB005、JTZB006、JTZB063 have expectorant effects.

endophytes from Glycyrrhiza uralensis; expectorant; inflammation-associated factors; Aquaporin; rat

R285.5

A

1000-6834(2017)05-410-05

10.12047/j.cjap.5495.2017.099

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360633)

2016-12-09

2017-06-22

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