曲雪松， 石 輝,2， 曹秀麗， 董雪帆， 李 甜， 焦娟娟， 祁金順， 武美娜△

(1. 山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學省部共建教育部重點實驗室， 太原 030001；2. 內蒙古赤峰市醫(yī)院重癥醫(yī)學科， 赤峰 024000)

脂聯(lián)素改善阿爾茨海默病模型小鼠焦慮情緒及工作記憶*

曲雪松1， 石 輝1,2， 曹秀麗1， 董雪帆1， 李 甜1， 焦娟娟1， 祁金順1， 武美娜1△

(1. 山西醫(yī)科大學生理學系， 細胞生理學省部共建教育部重點實驗室， 太原 030001；2. 內蒙古赤峰市醫(yī)院重癥醫(yī)學科， 赤峰 024000)

目的探討脂聯(lián)素(APN)預處理對9月齡三轉基因阿爾茨海默病(3xTg-AD)模型小鼠學習記憶能力和焦慮情緒的影響。方法選取9月齡3xTg-AD小鼠及C57BL/6J小鼠，分為4組：WT+Saline組、3xTg-AD +Saline組、WT+APN組和3xTg-AD +APN組，每組8只。將全部小鼠進行側腦室埋管術后，恢復7 d，在自由清醒狀態(tài)下分別經(jīng)側腦室給予生理鹽水或APN，采用曠場、新物體識別及Y-迷宮3種行為學手段檢測小鼠的情緒及學習記憶能力。結果①在曠場實驗中，與WT+Saline組小鼠相比，3xTg-AD +Saline組小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間明顯縮短，在外周區(qū)域的活動時間明顯延長，給予APN后可有效逆轉3xTg-AD小鼠的該現(xiàn)象，表明脂聯(lián)素可有效緩解3xTg-AD小鼠的焦慮情緒。②新物體識別實驗中，3xTg-AD+Saline組小鼠的辨別指數(shù)為(-16.7±10.1)%，明顯低于WT+Saline組的(18.0±8.2)%(P<0.01)和3xTg-AD +APN組的(15.7±8.8)%(P<0.01)，表明脂聯(lián)素可明顯改善3xTg-AD小鼠的識別記憶能力損傷。③Y-迷宮實驗中，3xTg-AD +Saline組小鼠的自發(fā)交替正確率為(40.0±1.7)%，明顯低于WT+Saline組的(56.6±4.6)%(P<0.01)和3xTg-AD +APN組的(53.9±5.6)%(P<0.01)，表明脂聯(lián)素能夠逆轉3xTg-AD小鼠工作記憶能力的損傷。結論脂聯(lián)素可以改善9月齡3xTg-AD小鼠的焦慮情緒及識別記憶和工作記憶能力損傷，可能在AD的預防和治療中發(fā)揮有效作用。

脂聯(lián)素；阿爾茨海默?。蝗D基因小鼠；焦慮；學習記憶

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是1906年首次被報道的一種原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。2015年阿爾茨海默病報告顯示，目前全世界已有超過4 600萬人受累于此病，其中2015年新發(fā)癡呆病例為990萬，且該數(shù)字每20年會翻倍，可見AD已嚴重危害人類的健康[1]。AD的臨床表現(xiàn)主要為認知功能障礙和學習記憶能力下降，同時伴有焦慮、抑郁等情緒方面的變化。AD的典型病理特征包括老年斑、神經(jīng)原纖維纏結、神經(jīng)元丟失和腦萎縮。老年斑的核心成分為β淀粉樣蛋白(amyloid β protein, Aβ)，它由β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein, β-APP)水解形成；神經(jīng)原纖維纏結則由tau蛋白過度磷酸化導致。同時早老素(presenilin, PS)1和PS2基因在AD的發(fā)病過程中也起著重要作用。三轉基因AD模型小鼠(triple-transgenic AD model, 3xTg-AD)同時包含有PS1M146V, APPSwe和TauP301L 3種基因的突變，不僅能夠模擬AD患者的臨床表現(xiàn)，而且能同時表現(xiàn)出老年斑和神經(jīng)原纖維纏結兩個典型的病理特征，是近年新建立的一種比較理想的AD動物模型[2]。

脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是1995年被首次報道的，一種來源于脂肪細胞的蛋白質激素。以往的研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素具有抗炎、增強胰島素敏感性、促進脂肪酸分解代謝及影響葡萄糖轉運等功能，與心血管疾病、2型糖尿病、肥胖等代謝類疾病密切相關[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，除在外周發(fā)揮作用，脂聯(lián)素也與包括AD在內的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關。Chan KH等人在細胞水平發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以減少人類成神經(jīng)細胞瘤細胞中Aβ的產(chǎn)生和沉積，對抗Aβ的神經(jīng)毒性作用[4]。在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，脂聯(lián)素可以對抗海人藻酸的興奮毒性，減少KA引起的活性氧產(chǎn)生及Caspase-3的激活[5]。然而，目前對于脂聯(lián)素神經(jīng)保護作用的研究大多停留在離體水平，在體動物水平的研究甚少，對于脂聯(lián)素在AD病程中對學習記憶能力損傷有何作用的研究更是少見。因此，本研究在假設脂聯(lián)素對AD具有神經(jīng)保護作用的基礎上，外源性給予3xTg-AD小鼠脂聯(lián)素，觀察其對3xTg-AD小鼠焦慮情緒、識別記憶和工作記憶能力損傷的影響，希望為預防和治療AD提供新的策略和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3xTg-AD小鼠由美國Jackson實驗室引進，并在山西醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)繁殖。野生型(wild type, WT)C57BL/6J小鼠為3xTg-AD小鼠的背景鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有小鼠均為雄性并且在清潔級條件下飼養(yǎng)，12/12 h光照黑暗交替，環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度為50%～60%，自由飲水，攝食。9月齡、體重在25～28 g之間的3xTg-AD和WT小鼠隨機分為4組：WT+Saline組，3xTg-AD+Saline組，WT+APN組，3xTg-AD+APN組，每組8只，分別經(jīng)側腦室慢性給予脂聯(lián)素或生理鹽水。將小鼠稱重后以0.03 ml/10 g水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于腦立體定位儀上，根據(jù)腦立體定位圖譜定位側腦室的位置(前囟后0.6 mm,旁開1.1 mm)[6]，用顱骨鉆鉆孔并將套管插入，牙科水泥固定，術后小鼠恢復1周開始給藥。脂聯(lián)素(Pepro Tech, USA)用生理鹽水溶解并配制為0.1 μg/4 μl的溶液，-20℃保存。在自由清醒狀態(tài)下對小鼠每天經(jīng)側腦室注射0.1 μg/4 μl 的脂聯(lián)素[7,8]或等體積的生理鹽水，連續(xù)注射10 d，10 d后開始行為學實驗，實驗期間持續(xù)給藥。

1.2 曠場實驗

曠場實驗箱的長寬高分別為55 cm×55 cm×30 cm，底面為一個正方形。將曠場平均分成25個小格,中間9個小格定義為中央?yún)^(qū)域，其余16個小格則為外周區(qū)域。實驗箱正上方2 m處架有一紅外攝像頭，其視野可以覆蓋整個曠場。實驗前將動物放到行為學實驗室適應24 h，實驗應在安靜環(huán)境中進行。實驗開始時，將小鼠放到曠場的正中央，讓其自由探索5 min。每只小鼠實驗結束后，都要用酒精擦拭曠場，以消除氣味對實驗結果的影響。記錄指標包括小鼠在曠場中的總運動距離、在中央?yún)^(qū)域的時間占總時間的百分比和在外周區(qū)域的時間占總時間的百分比。其中，曠場中的總運動距離可反映小鼠的運動能力，而通過計算小鼠在中央?yún)^(qū)域或外周區(qū)域的活動時間占總時間的百分比可反映小鼠的焦慮程度[9]。

1.3 新物體識別實驗

在曠場中放入兩個完全相同的物體，兩物體間相距25 cm并與兩側壁均相距15 cm。首先進行熟悉階段實驗，將小鼠從非物體區(qū)域的中間貼壁放入曠場中自由活動10 min，旨在使其對測試環(huán)境中的物體進行熟悉?；顒咏Y束后將小鼠放回籠中休息5 h，然后進行測試階段實驗。將曠場中的一個物體換成相同材質，但形狀和顏色不同的另一新物體，再將小鼠從同一位置放入，仍舊探索10 min，通過比較小鼠探索新物體和舊物體(熟悉階段所見過的物體)的時間來評判小鼠的識別記憶能力。分析指標包括物體識別指數(shù)(recognition index, RI)和辨別指數(shù)(discrimination index, DI)，物體識別指數(shù)=探索新物體時間或探索舊物體時間/(探索新物體時間+探索舊物體時間)×100%，辨別指數(shù)=(探索新物體的時間-探索舊物體的時間)/(探索新物體時間+探索舊物體時間)×100 %[10]。

1.4 Y迷宮自發(fā)交替實驗

Y迷宮由3個臂組成，各臂之間的夾角為120°，每個臂的長寬分別為30 cm×5 cm。實驗開始時，將小鼠放入三臂交匯處，讓其自由探索8 min，記錄小鼠總進臂次數(shù)和進臂順序并由此計算其自發(fā)交替的正確率。前兩次的進臂順序不計，從第3次開始計算，進入的臂與前兩次不同則為正確，否則錯誤。自發(fā)交替正確率=正確進臂次數(shù)/(總進臂次數(shù)-2)×100 %[11]。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 脂聯(lián)素可緩解3xTg-AD小鼠的情緒焦慮程度

曠場實驗可以反映小鼠的運動能力和焦慮情緒。四組小鼠在曠場中的總運動距離如表1所示，WT+APN組的總運動距離明顯高于WT+Saline組(P<0.05)，但3xTg-AD +Saline組和3xTg-AD +APN組的總運動距離與WT+Saline組相比均無統(tǒng)計學差異，表明安靜狀態(tài)下9月齡3xTg-AD小鼠的運動能力未發(fā)生改變，且脂聯(lián)素可以提高野生小鼠的運動能力，但對3xTg-AD小鼠的運動能力沒有影響。各組小鼠在中央?yún)^(qū)域或外周區(qū)域的活動時間占總時間的百分比如表1所示，3xTg-AD+Saline組在中央?yún)^(qū)域的時間百分比明顯低于WT+Saline組(P<0.01)，給予脂聯(lián)素后，3xTg-AD小鼠在中央?yún)^(qū)域的時間百分比明顯提高(P<0.01)。同時，3xTg-AD+Saline組小鼠在外周區(qū)域的時間百分比明顯高于WT+Saline組(P<0.01)和3xTg-AD +APN組(P<0.01)。以上結果表明9月齡3xTg-AD小鼠出現(xiàn)焦慮情緒，而脂聯(lián)素可以減輕小鼠的焦慮情緒。

2.2脂聯(lián)素可減輕3xTg-AD小鼠的識別記憶能力損傷

新物體識別實驗是利用嚙齒類動物喜歡探索新事物的特性，通過比較探索新舊物體所用的時間來檢測其識別記憶能力。表2顯示各組小鼠的新舊物體識別指數(shù)和辨別指數(shù)。結果表明，3xTg-AD+Saline組小鼠的舊物體識別指數(shù)高于新物體識別指數(shù)，且二者之間沒有統(tǒng)計學差異(t=-1.4,P>0.05)；但WT+Saline組小鼠的新物體識別指數(shù)明顯高于舊物體識別指數(shù)，且二者間具有統(tǒng)計學差異(t=2.9,P<0.05)，說明3xTg-AD小鼠沒有保留對舊物體的記憶，故無法辨別新舊物體，其識別記憶能力已經(jīng)損傷。給予脂聯(lián)素后，3xTg-AD小鼠的新物體識別指數(shù)明顯高于舊物體識別指數(shù)(t=2.8,P<0.05)，表明脂聯(lián)素可以減輕3xTg-AD小鼠識別記憶能力的損傷。此外，3xTg-AD+Saline組小鼠的辨別指數(shù)明顯低于WT+Saline組(P<0.01)，說明3xTg-AD小鼠遺忘了熟悉期見過的舊物體，花費了更多的時間去探索舊物體而減少了對新物體的探索。給予脂聯(lián)素干預后，3xTg-AD小鼠的辨別指數(shù)明顯升高 (P<0.01)，表明藥物處理后，3xTg-AD小鼠探索新物體的時間多于舊物體，即小鼠記住了以往見過的舊物體，從而利用更多的時間去探索新物體。以上結果表明9月齡3xTg-AD小鼠的物體識別記憶能力3xTg-AD已損傷，而脂聯(lián)素預處理可以改善這一損傷。

GroupDistance(cm)Timespentincenter(%)Timespentinperiphery(%)WT+Saline1959.4±447.130.6±5.169.4±5.1WT+APN2816.8±262.3*29.3±4.470.7±4.43xTg-AD+Saline1908.9±392.319.0±3.6**81.0±3.6**3xTg-AD+APN1863.1±244.128.3±4.5##71.7±4.5##

WT: Wild type; 3xTg-AD: Triple-transgenicAD; APN: Adiponectin

*P<0.05vsWT+Saline group；##P<0.01vs3xTg-AD+Saline group

GroupNovelobjectFamiliarobjectDiscriminationindexWT+Saline59.0±7.0*41.0±7.018.0±8.2##WT+APN65.8±6.6*34.2±6.631.7±7.73xTg-AD+Saline41.7±8.858.3±8.8-16.7±10.13xTg-AD+APN57.8±7.7*42.2±7.715.7±8.8##

*P<0.05vsfamiliar object group；##P<0.01vs3xTg-AD+Saline group

2.3脂聯(lián)素可改善3xTg-AD小鼠的工作記憶能力損傷

Y迷宮主要用于測試動物的工作記憶能力。各組小鼠的自發(fā)交替正確率如表3所示，3xTg-AD+Saline組明顯低于WT+Saline組(P<0.01)，表明9月齡3xTg-AD小鼠的工作記憶能力已經(jīng)出現(xiàn)明顯損害。經(jīng)過脂聯(lián)素干預后，3xTg-AD小鼠的進臂正確率明顯高于3xTg-AD+Saline組(P<0.01)，說明脂聯(lián)素能夠逆轉3xTg-AD小鼠工作記憶能力的損傷。此外，各組小鼠的總進臂次數(shù)沒有統(tǒng)計學差異，表明AD相關基因突變和脂聯(lián)素預處理均未對小鼠的運動能力和探索欲望產(chǎn)生影響。

GroupNumberofarmentriesSpontaneousalternation(%)WT+Saline32.7±2.756.6±4.6WT+APN33.6±2.560.1±5.23xTg-AD+Saline31.0±1.440.0±1.7**3xTg-AD+APN32.7±1.653.9±5.6##

**P<0.01vsWT+Saline;##P<0.01vs3xTg-AD+Saline

3 討論

三轉基因AD(3xTg-AD)小鼠是近年來比較流行的一種AD動物模型，能夠全面展示AD的病理特征，并表現(xiàn)出多種學習記憶能力的損傷，從而更好地模擬AD病人的臨床表現(xiàn)。研究表明，3xTg-AD小鼠4月齡時已出現(xiàn)長時程的記憶提取損傷，且隨著年齡的增長這種損傷將會逐漸加重[12]。本研究發(fā)現(xiàn)9月齡3xTg-AD小鼠的舊物體識別指數(shù)明顯升高，新物體識別指數(shù)明顯降低，辨別指數(shù)<0，提示3xTg-AD小鼠的識別記憶能力明顯損傷。同時，9月齡的3xTg-AD小鼠在Y迷宮實驗中的自發(fā)交替正確率也明顯下降，表明其短期工作記憶能力也受到損傷。此外，還發(fā)現(xiàn)9月齡3xTg-AD小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域的活動時間明顯縮短，而在外周區(qū)域活動時間延長，表現(xiàn)出一定的焦慮情緒。

脂聯(lián)素作為一種主要來源于脂肪細胞的蛋白質激素，是否在AD等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用，及其作用效果尚存爭議。流行病學調查發(fā)現(xiàn)血清脂聯(lián)素水平與AD的發(fā)病密切相關，在輕度認知功能障礙和AD患者中血清脂聯(lián)素水平明顯下降，且脂聯(lián)素減少是AD病程中的一個重要指標[13]。但也有研究發(fā)現(xiàn)AD患者血清脂聯(lián)素水平升高[14]，然而這種升高是AD發(fā)病的原因還是AD早期的代償性增加還難以確定。同時部分離體實驗證實，脂聯(lián)素可以減少Aβ的產(chǎn)生和沉積，對抗Aβ和KA的神經(jīng)毒性作用[4, 5]。此外，脂聯(lián)素還可以通過抑制NF-κB的激活來減少促炎因子的產(chǎn)生和增加抗炎因子的數(shù)量，從而減輕神經(jīng)炎癥反應，減慢神經(jīng)細胞凋亡的速度[15]。

有研究表明脂聯(lián)素的球狀結構域可以通過血腦屏障，但其進入腦內具有促進炎癥反應的作用[16]，故本研究選取全長型脂聯(lián)素，采用側腦室注射給藥的方法以確保脂聯(lián)素能夠直接在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，同時避免腹腔或靜脈給藥所帶來的廣泛外周效應。本研究采用3種不同的行為學手段觀察側腦室慢性給予脂聯(lián)素后對3xTg-AD小鼠的焦慮情緒、識別記憶和工作記憶能力損害的影響。在曠場實驗中發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可以減輕9月齡3xTg-AD小鼠的焦慮程度，而以往也曾報道側腦室注射脂聯(lián)素可以使小鼠的抑郁程度明顯降低[17]。因此我們推測，脂聯(lián)素可以緩解在AD病程中出現(xiàn)的焦慮、抑郁等多種情緒改變。在新物體識別實驗中，當給予脂聯(lián)素后，3xTg-AD小鼠對新物體的識別指數(shù)和辨別指數(shù)均明顯升高，表明其能夠識別出舊物體進而更多的去探索新物體，因此脂聯(lián)素可以有效改善3xTg-AD小鼠識別記憶能力的損傷。在Y迷宮實驗中，給予脂聯(lián)素后，3xTg-AD小鼠的自發(fā)交替正確率明顯提高，其工作記憶能力損傷明顯好轉。以上結果表明，脂聯(lián)素對3xTg-AD小鼠的物體識別記憶能力和短期工作記憶能力損傷均有明顯改善作用。而近期報道發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素的類似物Osmotin可以減輕Aβ1-42所導致的小鼠空間記憶能力損害，減少腦內Aβ的沉積及tau蛋白磷酸化[18]。因此我們推測脂聯(lián)素可能通過影響Aβ和磷酸化tau蛋白的水平，以及減輕神經(jīng)炎癥反應，來逆轉3xTg-AD小鼠出現(xiàn)的焦慮情緒和短期記憶能力損傷。

總之，本實驗結果表明，9月齡3xTg-AD小鼠具有明顯的焦慮情緒，其對新物體的識別能力和短期工作記憶能力也有明顯損傷；脂聯(lián)素預處理能夠有效改善其焦慮情緒和識別記憶、工作記憶能力的損傷。本研究為后續(xù)脂聯(lián)素與AD關系的研究提供初步的行為學實驗證據(jù)，提示脂聯(lián)素對于AD的預防和治療可能具有一定的積極作用。同時脂聯(lián)素發(fā)揮神經(jīng)保護作用的可能機制，例如能否直接減輕Aβ沉積和tau蛋白磷酸化，以及直接影響腦內促炎因子和抗炎因子的表達，減輕神經(jīng)炎性反應等，相關研究正在進行中。

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EffectsofadiponectinontheanxietyandmemoryimpairmentintripletransgenicAlzheimer'sdiseasemodelmice

QU Xue-song1, SHI Hui1,2, CAO Xiu-li1, DONG Xue-fan1, LI Tian1, JIAO Juan-juan1, QI Jin-shun1, WU Mei-na1△

(1. Department of Physiology, Shanxi Medical University, Key Laboratory for Cellular Physiology of Ministry ofEducation, Taiyuan 030001; 2. Intensive Care Unit, Chifeng Municipal Hospital of Inner Mongolia, Chifeng 024000, China)

Objective: To investigate the effects of adiponectin (APN) on anxiety and memory impairment of 9-month-old triple transgenic Alzheimer’s disease (3xTg-AD) model mice.MethodsThe 9-month-old 3xTg-AD mice and C57BL/6J mice were randomly divided into four groups (n=8 for each group): Wild type(WT)+Saline, 3xTg-AD +Saline, WT+APN and 3xTg-AD +APN group. All mice were implanted cannula in lateral ventricle and each mouse was intracerebroventricular injected with adiponectin or saline under free moving condition after 7 days recovery. The anxiety and memory ability of each mouse were observed by using open field test, object recognition task and Y-maze test.Results①In the open field test, compared to WT+Saline group, the time of 3xTg-AD +Saline mice spent in center was significantly decreased, and the time spent in periphery was obviously increased. However, APN treatment effectively reversed the phenomenon appeared in 3xTg-AD mice, indicating that APN could alleviate the anxiety observed in 3xTg-AD mice. ②In novel object recognition task, the discrimination index of 3xTg-AD+Saline group was (-16.7±10.1)%, significantly lower than (18.0±8.2)% in WT+Saline group (P<0.01) and (15.7±8.8)% in 3xTg-AD+APN group (P<0.01), which indicated that APN could effectively prevent the recognition memory impairment in 3xTg mice. ③In Y-maze test, the spontaneous alternation rate of 3xTg-AD +Saline group was (40.0±1.7)%，significantly lower than (56.6±4.6)% in WT+Saline group and (53.9±5.6)% in 3xTg-AD +APN group (P<0.01), which indicated that APN could prevent working memory impairment in 3xTg-AD mice.ConclusionAdiponectin could effectively alleviate the anxiety and reverse the impairment of recognition memory and working memory of 9-month-old 3xTg-AD mice, and might play an important role in the prevention and treatment of AD.

adiponectin; Alzheimer’s disease (AD); triple-transgenic AD (3xTg-AD) mice; anxiety; learning and memory

R338

A

1000-6834(2017)05-405-05

10.12047/j.cjap.5498.2017.098

國家自然科學基金(31300968)；青年三晉學者支持計劃專項經(jīng)費資助

2016-10-08

2017-05-22

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