趙 燕， 付 玉

(成都體育學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院， 四川 成都 610041)

慢性應(yīng)激抑郁狀態(tài)對大鼠外周神經(jīng)內(nèi)分泌因子生物節(jié)律的影響*

趙 燕△， 付 玉

(成都體育學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院， 四川 成都 610041)

目的探討慢性不可預(yù)見性應(yīng)激狀態(tài)下大鼠外周神經(jīng)內(nèi)分泌因子晝夜節(jié)律的表達(dá)特點(diǎn)。方法成年雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為模型組和對照組(n=30)，采用束縛、搖晃、鼠籠傾斜、濕墊料、冷刺激 、擁擠(整夜)、斷食或斷水、夾尾、晝/夜顛倒等慢性不可預(yù)知性溫和刺激結(jié)合孤養(yǎng)方式，每天暴露于2種應(yīng)激原中飼養(yǎng)21 d，建立抑郁癥模型。測定應(yīng)激前后大鼠糖水偏愛、曠場行為及高架十字迷宮行為學(xué)變化。連續(xù)24 h分6個時間點(diǎn)(ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17、ZT21)處死動物取血，每個時間點(diǎn)處死5只大鼠。放免法測定6個時間點(diǎn)血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)含量，ELISA法測定6個相同時間點(diǎn)血漿皮質(zhì)酮(CORT)、褪黑素(MT)、血管活性腸肽(VIP)含量，采用單一余弦法比較2組大鼠上述各指標(biāo)的節(jié)律周期、振幅、峰值相位、中值的變化特點(diǎn)。結(jié)果與對照組相比，模型大鼠體重增加值明顯降低(P<0.01)，各項(xiàng)行為學(xué)評分均顯著減少(P<0.01)。慢性應(yīng)激至抑郁樣行為充分表達(dá)后，血漿ACTH、CORT的相位完全相反，時相大幅度提前，含量波動幅度減小，晝夜分泌節(jié)律紊亂；MT的24 h分泌節(jié)律完全喪失且整體水平下降，表達(dá)量顯著降低；VIP雖仍存在24 h節(jié)律，但振幅明顯降低，峰相位也延遲6 h，且表達(dá)量顯著提高。結(jié)論慢性應(yīng)激抑郁狀態(tài)可導(dǎo)致大鼠外周神經(jīng)內(nèi)分泌激素的近日節(jié)律非同步于SCN，表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性和激素分泌量的異常。

慢性不可預(yù)知性應(yīng)激；抑郁樣行為；神經(jīng)內(nèi)分泌因子；生物節(jié)律

哺乳動物的生理功能受內(nèi)源性生物鐘產(chǎn)生的近日節(jié)律(circadian rhythm)影響。這個生物鐘以丘腦下部的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)作為主起搏器，產(chǎn)生與周圍環(huán)境同步化的近日節(jié)律[1]。近日節(jié)律鐘(circadian clock)系統(tǒng)由一系列具有正向或負(fù)向調(diào)節(jié)功能的鐘基因及其產(chǎn)物構(gòu)成復(fù)雜的反饋網(wǎng)絡(luò)，并以近日基因轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控所形成的分子振蕩為機(jī)制，參與調(diào)控近日節(jié)律的生理和行為[2]。SCN主要接受來自視網(wǎng)膜的光信息經(jīng)視網(wǎng)膜-下丘腦路徑控制絕大多數(shù)外周節(jié)奏，其主要授時因子或同步器為光-暗周期。機(jī)體的生理功能、生化代謝、行為改變均表現(xiàn)出穩(wěn)定的晝夜節(jié)律現(xiàn)象，包括睡眠-覺醒交替、體溫節(jié)律及激素的分泌節(jié)律等。生物節(jié)律能保證人體更好地適應(yīng)外在環(huán)境的變化，如果發(fā)生紊亂，可能誘發(fā)多種生理性和精神性疾病。研究發(fā)現(xiàn)人體生物周期節(jié)律的紊亂與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切[3,4]。抑郁癥患者和動物模型均有明顯的近日節(jié)律改變，主要表現(xiàn)為睡眠障礙，情緒日夜變化，核心體溫的改變，以及激素、神經(jīng)遞質(zhì)等的合成、分泌和代謝也存在晝夜節(jié)律的失調(diào)，特別是褪黑素及下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的時相及分泌模式的異常[5,6]。本實(shí)驗(yàn)就慢性應(yīng)激抑郁狀態(tài)下大鼠外周神經(jīng)內(nèi)分泌激素晝夜節(jié)律表達(dá)變化的特點(diǎn)進(jìn)行了研究與探討。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只(由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，研究開始時體重220±20 g；大鼠血清皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)、褪黑素(melatonin，MT)及血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)酶聯(lián)免疫試劑盒均購自美國Rapid bio生物公司；大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放免分析試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供；全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)；漩渦振蕩器MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；半自動洗板機(jī)(Wellwash 4Mk2，Thermo，USA)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠飼養(yǎng)及造模 60只雄性SD大鼠自由飲食，光/暗周期為12 h/12 h(ZT0，開燈時間8:00 am；ZT12，關(guān)燈時間8:00 pm)，溫度20℃±2℃，濕度40%～50%。實(shí)驗(yàn)前用曠場分析法對每只大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，選擇各項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)得分相近的大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對照組(control)及模型組(Model)(n=30)，模型組單籠飼養(yǎng)。采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激[7]方式建立抑郁模型。此方法由以下不同應(yīng)激原組成，包括束縛(1 h)，搖晃(130 r/min，2 h)，鼠籠傾斜(整夜)，濕墊料(24 h)，冷刺激 (4℃，1 h)，擁擠(整夜)，斷食或斷水(24 h)，夾尾(3 min)，晝/夜顛倒(24 h)，大鼠每天暴露于2種應(yīng)激原中，順序隨機(jī)，共21 d，每組分別飼養(yǎng)于獨(dú)立房間，避免組間干擾。

1.2.2 體重增加量測定 分別測量記錄大鼠實(shí)驗(yàn)前1 d和行為學(xué)測試后體重，然后計(jì)算比較各組大鼠體重增長量。

1.2.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前48 h，訓(xùn)練大鼠適應(yīng)1%蔗糖水，然后斷水4 h，所有大鼠單籠放置，同時給予事先稱重的兩瓶水，分別為1%蔗糖水和純水。測定1 h糖水和純水消耗量，計(jì)算糖水引用百分比。

1.2.4 曠場實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置為一灰色、頂部無蓋、內(nèi)壁均為黑色的木制敞箱，大小約100 cm×100 cm×50 cm，底面劃分成25個方格(20 cm×20 cm)。實(shí)驗(yàn)時將大鼠輕置于敞箱中心方格內(nèi)，觀察5 min內(nèi)活動情況。觀察指標(biāo)包括水平運(yùn)動即穿越格數(shù)(4爪均進(jìn)入方格)；垂直運(yùn)動即后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁)；中央格停留時間：從放入開場試驗(yàn)箱中心開始至大鼠進(jìn)入外圍格的時間。一次實(shí)驗(yàn)完成后徹底清潔敞箱再進(jìn)行下一只大鼠觀察。

1.2.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 迷宮由4個臂組成，兩個相反方向的開放臂50×10 cm，兩個相反方向的封閉臂50×10×40 cm，頂部敞開，開放臂與封閉臂交叉處有一10×10 cm的中央敞開部，封閉臂和開放臂的底部離地面50 cm。將實(shí)驗(yàn)大鼠放于迷宮中央，面向一個開放臂，記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況。觀察指標(biāo)包括5 min內(nèi)四肢全部進(jìn)入開放臂(open-arms)或閉臂(enclosed-arms)的次數(shù)，及在兩臂停留時間。計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)(open-arms entries, OE)和在開臂滯留時間(open-arms time, OT)分別占兩臂總次數(shù)(total entries, TE)和總時間(total time, TT)的百分比。實(shí)驗(yàn)完成后將小鼠取出，將兩臂清理干凈，噴灑酒精除去氣味，再進(jìn)行下1只大鼠測試。

1.2.6 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測 行為學(xué)檢測結(jié)束后第2天，連續(xù)24 h分6個時間點(diǎn)(ZT1、ZT5、ZT9、ZT13、ZT17、ZT21)斷頭處死大鼠，每個時間點(diǎn)處死5只，取血收集于EDTA處理的塑料管中，室溫靜置10 min，2 500 r/min離心10 min后吸取上層血清，分裝放入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。放射免疫法檢測6個時間點(diǎn)血清ACTH含量；ELISA法檢測6個相同時間點(diǎn)血清CORT、MT、VIP含量，具體操作按試劑盒說明書所述步驟進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CUMS對大鼠體重的影響

造模前2組大鼠體質(zhì)量無明顯差異。CUMS造模后模型組大鼠體質(zhì)量及其增長值明顯下降 (P<0.01，表1)。

GroupPre-modelingPost-modelingWeightgainControl233.65±13.53312.29±15.4278.42±11.16Model230.33±16.21205.63±24.09**-25.20±17.34**

**P<0.01vscontrol group

2.2 CUMS對大鼠行為學(xué)的影響

與對照組比較，模型組大鼠糖水偏好度明顯降低(P<0.01)，水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動評分及中央格停留時間均顯著下降(P<0.01)；高架十字迷宮結(jié)果顯示，模型大鼠在OE、OT、TE和TT的百分比方面均顯著低于對照組(P<0.01，表2、表3)。

GroupSucrosepreference(%)Open-FieldScoreHorizontalmovementVerticalmovementTimeincentralgrid(s)Control80.28±15.77106.13±16.8616.58±5.320.9±0.84Model51.64±19.26**61.81±20.38**8.9±4.33**0.25±1.03**

**P<0.01vscontrol group

GroupOE(time)OT(s)OE/TE(%)OT/TT(%)Control1.63±0.5128.99±4.6624.57±6.3313.26±4.51Model0.8±0.74**13.07±6.45**12.41±5.27**4.70±3.32**

OE: Open-arms entries; OT: Open-arms time; TE: Total entries; TT: Total entries

**P<0.01vscontrol group

2.32組大鼠不同時間點(diǎn)血清ACTH、CORT、MT、VIP含量及晝夜節(jié)律參數(shù)特征比較

對照組大鼠血清中ACTH、CORT、MT、VIP含量具有明顯的晝夜節(jié)律。慢性應(yīng)激至抑郁樣行為充分表達(dá)后，模型大鼠血清ACTH、CORT的晝夜節(jié)律紊亂，峰相位與對照組完全相反，時相大幅度提前，且振幅降低。MT的24 h分泌節(jié)律也完全喪失，表達(dá)量顯著降低，峰相位大幅提前14 h，且振幅減小，整體水平下調(diào)。血清VIP的24 h表達(dá)量顯著高于對照組，雖仍存在晝夜節(jié)律，但節(jié)律振幅降低，峰相位也延遲6 h(表4、表5，圖1、圖2)。

GroupACTHCORTControl89.461±2.47477.365±4.225Model96.949±2.23183.918±3.025

ACTH: Adrenocorticotropic hormone; CORT: Glucocorticoid

GroupMTVIPControl5.769±0.16764.420±1.823Model2.773±0.15881.120±2.055

MT: Melatonin; VIP: Vasoactive intestinal peptide

ZT: Zeitgeber time; ACTH: Adrenocorticotropic hormone; CORT: Glucocorticoid

*P<0.05vscontrol group

ZT: Zeitgeber time; MT: Melatonin; VIP: Vasoactive intestinal peptide

*P<0.05vscontrol group

3 討論

CUMS是一種被廣泛認(rèn)可的抑郁癥動物模型，具有良好的外觀效應(yīng)、預(yù)測性和建構(gòu)效度。本研究采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)的方法建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型，觀察大鼠抑郁樣行為，并使用糖水實(shí)驗(yàn)、開場實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮進(jìn)行抑郁模型動物的行為學(xué)評價(jià)。在糖水消耗實(shí)驗(yàn)中，與對照組比較，21 d CUMS處理的模型大鼠糖水消耗量及偏愛度均顯著下降，表明CUMS應(yīng)激后的大鼠表現(xiàn)出快感缺失，提示其出現(xiàn)抑郁樣的典型癥狀。曠場實(shí)驗(yàn)中，水平和直立運(yùn)動可以反映動物的探究性行為，中央格停留時間的長短可衡量大鼠的焦慮情緒，與對照組相比，21 d CUMS刺激后，模型組大鼠活動力明顯降低，表現(xiàn)為水平運(yùn)動、直立運(yùn)動及中央格停留時間均顯著下降。本研究還采用高架十字迷宮來測試大鼠情緒的變化。結(jié)果顯示，模型大鼠在OE、OT分別占TE和TT的百分比方面顯著低于對照組，說明CUMS慢性刺激對大鼠的焦慮情緒有明顯影響。以上行為學(xué)改變與抑郁癥患者所表現(xiàn)的精神運(yùn)動改變、興趣減退及快感喪失有一定程度的相似性，表明CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥發(fā)病常伴有神經(jīng)內(nèi)分泌功能的改變，特別是褪黑素及HPA軸的異常。MT是松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其生物學(xué)作用涉及鎮(zhèn)靜、睡眠-覺醒周期、體溫調(diào)節(jié)、情緒性行為調(diào)節(jié)及內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等多個方面[8]。生理狀態(tài)下褪黑素與生物節(jié)律調(diào)節(jié)密切相關(guān)。作為一種重要的內(nèi)分泌輸出信號，MT被認(rèn)為是機(jī)體生物鐘的內(nèi)源性同步器，可在晝夜節(jié)律中同步化SCN和外周組織[9]。MT將松果腺感受的光-暗信號傳遞到SCN，與SCN上的受體結(jié)合，通過受體后機(jī)制發(fā)揮對生物節(jié)律的動態(tài)調(diào)節(jié)。MT的分泌存在明顯的晝夜節(jié)律，能夠穩(wěn)定和加強(qiáng)晝夜節(jié)律并保持相互的相位關(guān)系[10]。研究顯示MT與抑郁癥密切相關(guān)：抑郁癥患者血漿褪黑素及其代謝產(chǎn)物水平明顯低下，皮質(zhì)醇/MT比值增高；抑郁發(fā)作時MT分泌量、分泌節(jié)律位相及幅度均異常；一般認(rèn)為，發(fā)作期間MT分泌下降，緩解后MT分泌再度上升[11，12]。本實(shí)驗(yàn)通過對大鼠血清MT晝夜含量的測定及halberg余弦分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組大鼠血漿褪黑素水平顯示了強(qiáng)大的晝夜節(jié)律。21 d的CUMS刺激后，模型大鼠MT的24 h分泌節(jié)律完全喪失，表達(dá)量顯著降低，整體水平下調(diào)，且波動幅度減少；MT的晝夜節(jié)律亦紊亂，表現(xiàn)為振幅減小，峰相位提前14 h，這種由CUMS誘導(dǎo)的血漿褪黑素水平的降低與以往關(guān)于抑郁癥患者的臨床報(bào)道相一致[13]。

HPA軸是人體應(yīng)對應(yīng)激的重要神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，其在個體面對壓力源時, 可以通過一系列途徑使激素水平升高,從而使人體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。生理狀態(tài)下HPA軸活性呈近日節(jié)律性變化，且ACTH的分泌節(jié)律與CORT的晝夜分泌節(jié)律變化同步[14]。CORT作為HPA軸的終產(chǎn)物，其循環(huán)分泌主要通過HPA軸受SCN的調(diào)節(jié)，并在SCN和外周振蕩器之間起到溝通相位信息的作用[15]。抑郁癥患者多表現(xiàn)為HPA軸功能亢進(jìn)，晝夜節(jié)律呈現(xiàn)紊亂狀態(tài)，如CORT的時相改變、分泌的不穩(wěn)定模式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：慢性應(yīng)激至抑郁樣行為充分表達(dá)后，模型組大鼠血清ACTH、CORT的晝夜分泌節(jié)律紊亂，含量波動幅度減?。怀霈F(xiàn)晝夜節(jié)律的完全倒置，峰相位也與對照組完全相反，且時相大幅度提前，振幅降低。

研究發(fā)現(xiàn)抑郁狀態(tài)下可出現(xiàn)胃腸功能的紊亂，如精神心理障礙與功能性胃腸病的共病率約在42%～61%，最常見的是焦慮障礙、心境障礙(包括重性抑郁)等，多數(shù)人精神心理障礙的起病先于或同時于胃腸道癥狀的發(fā)生。其相互作用的機(jī)制與腦-腸軸的調(diào)節(jié)障礙有關(guān)。VIP是與胃腸道功能密切相關(guān)的腦腸肽，分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道粘膜、胃腸壁神經(jīng)叢。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明VIP可以抑制小腸傳導(dǎo)[16]。既往研究也發(fā)現(xiàn)，抑郁癥伴腸易激綜合征患者可出現(xiàn)血漿VIP含量的明顯升高，這種抑郁狀態(tài)下的異常分泌，進(jìn)一步導(dǎo)致胃腸動力和功能的改變[17]。同時VIP也是一個公認(rèn)的SCN的同步肽，可在晝夜節(jié)律中同步化SCN和外周組織[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過21 d的CUMS刺激后，應(yīng)激大鼠血清VIP的24 h表達(dá)量與對照組相比明顯增高，晝夜含量波動幅度降低；雖仍存在晝夜節(jié)律，但明顯減弱，振幅也低于對照組，峰相位延遲約6 h。

綜上所述，CUMS可引起大鼠外周神經(jīng)內(nèi)分泌激素的近日節(jié)律非同步于SCN，出現(xiàn)晝夜節(jié)律性和激素分泌量的異常，提示生物節(jié)律的紊亂可能在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮著重要的作用。而抑郁狀態(tài)下，生物節(jié)律的中樞調(diào)控機(jī)制還存在許多未知，在后續(xù)研究中擬從分子水平進(jìn)一步探討生物節(jié)律異常與抑郁癥發(fā)生的相關(guān)性，并開展有效干預(yù)措施的研究，提高機(jī)體對精神性應(yīng)激損傷的抵御能力。

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Effectsofchronicstressdepressiononthecircadianrhythmofperipheralneuroendocrinehormoneofrats

ZHAO Yan△， FU Yu

(College of Sports Medicine and Health, Chengdu Sport University, Chengdu 610041, China)

Objective: To investigate the circadian rhythmic alterations of plasma hormone and peptide induced by chronic unpredictable mild stress(CUMS).MethodsSixty male SD rats were randomly divided into two groups, model group and control group(n=30). Rats in model group

CUMS procedure (restraint, rotation, cage tilt, wet sawdust, cold, crowding, food or water deprivation, clamp tail and reverse light/dark cycle). Rats were randomly exposed to two stressors every day for 3 weeks. Exploratory locomotor activity was assessed by open field test and anxiety-like behavior was measured by elevated plus-maze test, and lack of pleasure by sucrose preference test. Blood samples were collected at each of six time points zeitgeber time (ZT1, 5, 9, 13, 17 and 21), 5 rats were executed at each time point. Plasma concentrations of corticosterone(CORT), melatonin (MT) and vasoactive intestinal peptide (VIP) were detected by ELISA kits, and plasma concentration of adrenocorticotropic hormone (ACTH) was determined by radioimmunoassay. The circadian rhythm changes of serum CORT, MT, VIP and ACTH in each group were compared by using cosinor.ResultsCompared with control group, locomotor activity, rearing, weight gain and sucrose consumption in model group were decreased significantly. The values of the percentage of open-arm time (OT) and open arm entries (OE) were obviously lower in the model group than those in the control group. The circadian rhythm of plasma ACTH and CORT showed an obvious disorder, including phase advance and decrease in amplitude, and markedly blunted circadian rhythm. There also showed a markedly blunted circadian rhythm and decreased levels of plasma MT. VIP still had 24-hour rhythm, but the amplitude was significantly lower, peak phase also delayed for six hours, and expression was significantly higher.ConclusionCUMS induces these peptides and hormones desynchronized from suprachiasmatic nucleus(SCN), manifested as the disturbed circadian rhythms and the abnormal hormone secretion of these synchronizers.

chronic unpredictable mild stress； depressive-like behavior； neuroendocrine factor； circadian rhythms

R395.6

A

1000-6834(2017)05-398-05

10.12047/j.cjap.5529.2017.096

成都體育學(xué)院博士基金項(xiàng)目(15YJBS05)；成都體育學(xué)院科研骨干出國進(jìn)修計(jì)劃(2016-2017)；四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(13za0074)；四川省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(13TD0010)；國家體育總局運(yùn)動醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨運(yùn)動醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助基金(2014CTYY005)

2016-11-28

2017-07-03

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