孫曉娟， 馮武龍， 侯 娜

(咸陽(yáng)師范學(xué)院體育學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712000)

JAK2/STAT3信號(hào)通路在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用*

孫曉娟△， 馮武龍， 侯 娜

(咸陽(yáng)師范學(xué)院體育學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712000)

目的探討Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)信號(hào)通路在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)(EP)抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、力竭組(EE組)、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組(EP組)、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+AG490組(EP+AG組)(n=20)。連續(xù)3 d的間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)建立EP動(dòng)物模型，力竭運(yùn)動(dòng)致大鼠運(yùn)動(dòng)性心肌損傷。采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡改變、Western blot法檢測(cè)心臟Caspase-3定量表達(dá)的變化，免疫組織化學(xué)法和Western blot法顯示心臟p-JAK2和p-STAT3定位和定量表達(dá)的變化。結(jié)果與C組相比，EE組心肌細(xì)胞凋亡、心臟Caspase-3、p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均顯著升高；與EE組相比，EP組心肌細(xì)胞凋亡和心臟Caspase-3表達(dá)明顯降低，而心臟p-JAK2和p-STAT3表達(dá)顯著升高；與EP組相比，EP+AG組心肌細(xì)胞凋亡和心臟Caspase-3表達(dá)均顯著升高，而心臟p-JAK2和p-STAT3表達(dá)明顯降低。結(jié)論EP可誘導(dǎo)心臟磷酸化JAK2和STAT3表達(dá)增加，減少心臟Caspase-3的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路參與了EP抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

JAK2/STAT3通路；運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)；力竭運(yùn)動(dòng)；心肌細(xì)胞凋亡；大鼠

近年來(lái)，運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)(exercise preconditioning, EP)的心肌保護(hù)效應(yīng)引起人們的關(guān)注。短暫的重復(fù)多次的較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使心肌的缺血缺氧損傷減輕，這種通過(guò)運(yùn)動(dòng)致心肌相對(duì)缺血誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的現(xiàn)象稱為EP[1]。研究證實(shí)EP能減少缺血后心肌梗死面積，促進(jìn)缺血后心功能恢復(fù)，減

輕心律失常發(fā)生，同時(shí)還參與心肌細(xì)胞抗凋亡作用[2,3]，但目前關(guān)于EP心肌保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全明確。近年研究發(fā)現(xiàn)Janus激酶2-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3, JAK2/STAT3)信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)存在的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激、增殖、凋亡等多種生理及病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。較多研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路在缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning, IP)和藥物預(yù)適應(yīng)的抗心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5,6]，而該通路是否參與EP的抗心肌細(xì)胞凋亡作用，目前尚不清楚。因此，本研究擬在EP動(dòng)物模型和力竭運(yùn)動(dòng)致運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的基礎(chǔ)上，研究EP對(duì)心肌組織JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響，探討該通路在EP抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

JAK2激酶抑制劑(AG490，美國(guó)Calbiochem公司)；磷酸化JAK2(p-JAK2)抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、Caspase-3抗體(美國(guó)Cell signaling公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠80只，體重220～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每天進(jìn)行1次持續(xù)10 min的適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為15 m/min。1周后將大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。對(duì)照組(C組)、力竭組(EE組)、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)組(EP組)、運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)+AG490組(EP+AG組)。建立EP動(dòng)物模型，大鼠在跑臺(tái)上完成連續(xù)3 d的間歇運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min/d，運(yùn)動(dòng)速度為28～30 m/min。在每天60 min的跑臺(tái)訓(xùn)練中，運(yùn)動(dòng)15 min，休息3～5 min，重復(fù)運(yùn)動(dòng)3次。C組：不進(jìn)行任何處理。EE組：以30 m/min的速度運(yùn)動(dòng)至力竭。EP組：先進(jìn)行3 d 的EP，24 h后運(yùn)動(dòng)至力竭。EP+AG組：每天EP前10 min，腹腔注射JAK2特異性抑制劑AG490(3 mg/kg)，余處理同EP組。

1.3 樣本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后30 min，采用0.4%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g體重)將各組大鼠腹腔麻醉后，呈仰臥位姿勢(shì)固定，將每組1/2大鼠打開胸腔，摘取心臟，用預(yù)冷的滅菌生理鹽水沖洗數(shù)次后，速凍于液氮中，后放置于-80℃冰箱保存，用于Western blot技術(shù)的檢測(cè)。其余每組1/2大鼠進(jìn)行心臟的常規(guī)灌注固定，摘取心臟，放入4%的多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜。心臟組織經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟和石蠟包埋，用于TUNEL法測(cè)定和免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.4 心肌細(xì)胞凋亡的測(cè)定

心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書流程進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下可見凋亡心肌細(xì)胞的胞核呈棕褐色，正常心肌細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色。每組隨機(jī)取切片5張，每張切片隨機(jī)取視野5個(gè)(×400)，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。心肌凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Western blot 蛋白印跡檢測(cè)

稱取心肌組織100 mg，加入300 μl預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提試劑，冰上勻漿。裂解30 min后，4℃ 14 000 r/min離心15 min收集上清液。取上清液經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，恒流300 mA過(guò)夜)，然后洗膜，以5% BSA溶液室溫封閉1 h，加入p-JAK2(1∶2 000)、p-STAT3(1∶2 000)、Caspase-3(1∶1 000)一抗4℃孵育過(guò)夜，再次洗膜后加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體，室溫孵育膜1 h，用KCTM化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)曝光顯示目的蛋白反應(yīng)性條帶，采用X線拍照并記錄。以Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，以各組蛋白表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH比值作為結(jié)果。

1.6 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用SP兩步法免疫組化方法。制作常規(guī)石蠟切片，切片按流程脫蠟至水；室溫3% H2O2去離子水溶液孵育切片10 min；室溫復(fù)合消化液孵育切片10 min；滴加一抗(兔抗p-JAK2抗體和p-STAT3抗體)，4℃孵育過(guò)夜；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育切片20 min；DAB顯色；脫水，透明，封片。Olympus顯微鏡下觀察并拍照。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞凋亡染色結(jié)果

凋亡心肌細(xì)胞核呈棕褐色，正常心肌細(xì)胞核被蘇木精復(fù)染呈藍(lán)色。C組可見凋亡的心肌細(xì)胞呈散在分布(圖1A)；EE組可見廣泛分布的大量凋亡心肌細(xì)胞(圖1B)；EP組可見少量的凋亡心肌細(xì)胞(圖1C)；EP+AG組可見較多的凋亡心肌細(xì)胞(圖1D)。心肌凋亡指數(shù)圖像分析顯示：與C組相比，各實(shí)驗(yàn)組心肌凋亡指數(shù)均升高(P<0.05)；與EE組相比，EP組心肌凋亡指數(shù)降低(P<0.05)；EP+AG組心肌凋亡指數(shù)較EP組升高(P<0.05, 表1)。

2.2 心臟Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

Western blot免疫印跡結(jié)果顯示：與C組相比，EE組、EP組和EP+AG組心臟Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；EP組心臟Caspase-3蛋白表達(dá)水平較EE組明顯降低(P<0.05)；與EP組相比，EP+AG組心臟Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖2、表1)。

Fig.1Result of myocardial apoptosis staining (TUNEL ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

GroupApoptoticindexofmyocardium(%)Caspase-3expressionC9.5±2.60.142±0.052EE47.6±6.2*0.506±0.123*EP23.4±4.1*#0.287±0.069*#EP+AG36.9±5.8*△0.446±0.082*△

C: Control; EE: Exercise exhaust; EP: Exercise preconditioning; AG: Janus kinase 2(JAK2) inhibitor AG490

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsEE group;△P<0.05vsEP group

Fig.2Expression change of Caspase-3 in heart

2.3 心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)的變化

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：心臟p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)主要位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞核，呈棕褐色。C組心臟p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)少，可見散在分布的棕褐色細(xì)胞核(圖3A、圖4A)；EE組心臟p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，可見一定量的棕褐色細(xì)胞核(圖3B、圖4B)；EP組心臟p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)較EE組進(jìn)一步增強(qiáng)，可見大量的棕褐色細(xì)胞核(圖3C、圖4C)；EP+AG組心臟p-JAK2和p-STAT3陽(yáng)性表達(dá)較EP組減少(圖3D、圖4D)。

Western blot免疫印跡結(jié)果顯示：與C組相比，EE組、EP組和EP+AG組心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；EP組心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平又較EE組明顯升高(P<0.05)；與EP組相比，EP+AG組心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05，圖5，表2)。

Fig.3Result of p-JAK2 immunoreactivity in heart (DAB ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

Fig.4Result of p-STAT3 immunoreactivity in heart (DAB ×400)

A: Control group; B: Exhaustive exercise group; C: Exercise preconditioning group; D: Exercise preconditioning + AG490 group

Fig.5Expression change of p-JAK2 and p-STAT3 in heart

Groupp-JAK2p-STAT3C0.149±0.0630.189±0.093EE0.294±0.085*0.304±0.118*EP0.456±0.156*#0.585±0.198*#EP+AG0.277±0.095*△0.321±0.145*△

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsEE group;△P<0.05vsEP group

3 討論

細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的一種特殊存在形式，其過(guò)程是受基因控制的主動(dòng)死亡過(guò)程。研究表明力竭運(yùn)動(dòng)和超負(fù)荷大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的加大，凋亡細(xì)胞的數(shù)目上升，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)性心肌損傷發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[7,8]。而EP作為一種有效的內(nèi)源性心肌保護(hù)措施，被證實(shí)能減少心肌細(xì)胞凋亡。Quindry等[9]對(duì)SD大鼠進(jìn)行連續(xù)3 d的EP跑臺(tái)訓(xùn)練，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 d運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以使缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面積明顯減少，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和Caspase-3表達(dá)明顯減少，提示EP可通過(guò)抑制心肌Caspase-3的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心臟起到保護(hù)作用。彭峰林等[10]探討EP對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)和一次高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)都能減少缺血/再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值增加，說(shuō)明對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)是EP心肌保護(hù)的重要機(jī)制之一。本課題組[11]前期對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)3天的間歇跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，每天以28～30 m/min的速度運(yùn)動(dòng)60 min，發(fā)現(xiàn)EP可以使大鼠心肌缺血損傷明顯減輕，表明3 d的跑臺(tái)訓(xùn)練能夠促使心肌產(chǎn)生EP保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究JAK2/STAT3信號(hào)通路在EP抑制心肌凋亡中的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Caspase家族是執(zhí)行細(xì)胞凋亡作用的一組半胱氨酸蛋白酶，其成員Caspase-3是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志酶。Caspase-3通過(guò)對(duì)蛋白激酶、核酸酶及細(xì)胞骨架的裂解，直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡，被認(rèn)為是執(zhí)行死亡蛋白酶[12]。本實(shí)驗(yàn)在EP動(dòng)物模型和力竭運(yùn)動(dòng)致運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的基礎(chǔ)上，用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡改變，用Western blot方法檢測(cè)心臟Caspase-3蛋白表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C組相比，EE組心肌細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)心臟Caspase-3蛋白的表達(dá)升高，提示力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與EE組相比，EP組心肌細(xì)胞凋亡和心臟Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯下降。提示EP通過(guò)下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

JAK/STAT信號(hào)通路是1992年發(fā)現(xiàn)的廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑。多種細(xì)胞外信號(hào)刺激引起JAKs的激活，激活的JAKs促使酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而使STATs磷酸化而被活化，激活的STATs移位到細(xì)胞核中，啟動(dòng)相應(yīng)的目的基因表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)作用[13]。研究顯示JAK2/STAT3信號(hào)通路激活后可調(diào)控心肌凋亡相關(guān)因子的表達(dá)。Hattori等[14]發(fā)現(xiàn)IP可激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，明顯增加磷酸化JAK2、磷酸化STAT3和Bcl-2的表達(dá)，減少Bax和Caspase-3的表達(dá)，從而縮小心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善缺血后的心臟收縮功能。使用JAK2特異性阻斷劑AG490，能取消該通路的心肌保護(hù)作用，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路在IP抑制心肌凋亡中起重要作用。學(xué)者們采用過(guò)氧化氫和姜黃素等藥物預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠的心肌保護(hù)作用[6,15]，均能誘導(dǎo)心肌JAK2和STAT3的磷酸化，減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡，預(yù)處理前給予JAK2抑制劑AG490后，磷酸化JAK2和STAT3表達(dá)水平下調(diào)，預(yù)適應(yīng)的心肌保護(hù)效應(yīng)也被抑制。綜上所述，IP和藥物預(yù)適應(yīng)均能通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，上調(diào)磷酸化JAK2和STAT3表達(dá)水平，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌起保護(hù)作用。

研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路在IP和藥物預(yù)適應(yīng)的抗心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用，而EP作為IP的一種特殊形式，我們認(rèn)為JAK2/STAT3信號(hào)通路可能參與了EP的抗心肌細(xì)胞凋亡作用。本研究在EP動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法，對(duì)心臟中p-JAK2和p-STAT3表達(dá)進(jìn)行了定位和定量研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致顯示，與EE組相比，EP組心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)顯著增加，而同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡和心臟Caspase-3表達(dá)均明顯下降。本實(shí)驗(yàn)在EP前給予JAK2激酶抑制劑AG490阻斷下游STAT的活化，發(fā)現(xiàn)EP+AG組心臟p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)較EP組明顯減少，而心臟Caspase-3表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路是Caspase-3的前提，該通路在EP抗心肌細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)控作用。

綜上所見，JAK2/STAT3信號(hào)通路參與了EP的心肌保護(hù)作用，EP通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)心臟磷酸化JAK2和STAT3表達(dá)增加，下調(diào)心臟Caspase-3表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)作用。

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TheroleofJAK2/STAT3signalingpathwayinexercisepreconditioningagainstmyocardialapoptosis

SUN Xiao-juan1△, FENG Wu-long1, HOU Na1

(1. School of Sport, Xianyang Normal University, Xianyang 712000, China)

Objective: To study the effects of Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription 3 (JAK2/STAT3) in exercise preconditioning (EP) against myocardial apoptosis.MethodsEighty healthy male SD rats were randomly divided into control group(C), exercise exhaust(EE) group, EP group, and EP+JAK2 inhibitor AG490(AG) group(n=20). By using 3 days intermittent treadmill exercise, the EP animal model was established, and myocardial injury was induced by exhaustive exercise on treadmill. The changes of myocardial apoptosis were evaluated by TUNEL. The expressions of Caspase-3, p-JAK2 and p-STAT3 in heart were detected by Western blot or immunohistochemistry.ResultsCompared with group C, myocardial apoptosis, and the expressions of Caspase-3, p-JAK2, and p-STAT3 in heart were increased significantly in group EE. Compared with group EE, myocardial apoptosis and the expression of Caspase-3 were decreased significantly, while the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were increased significantly in group EP. Compared with group EP, myocardial apoptosis and the expression of Caspase-3 were increased significantly, while the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 were decreased significantly in group EP+AG.ConclusionEP could increase the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 and decrease the expression of Caspase-3 in heart, which further mitigate myocardial apoptosis. Hence, JAK2/STAT3 pathway may participate in EP against myocardial apoptosis.

JAK2/STAT3 pathway; exercise preconditioning; exhaustive exercise; myocardial apoptosis; rat

R318

A

1000-6834(2017)05-393-05

10.12047/j.cjap.5473.2017.095

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(16JK1830)；2016咸陽(yáng)師范學(xué)院國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201610722029)

2016-07-13

2017-05-17

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