宗磊 任廣巖 胡瀟 郝正亮 王萃 祝驥 楊貞 盧德趙
浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053
絞股藍(lán)總皂苷調(diào)控CLIC1抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積的作用研究
宗磊 任廣巖 胡瀟 郝正亮 王萃 祝驥 楊貞 盧德趙
浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053
[目的]研究絞股藍(lán)總皂苷(gypenosides,GPs)對(duì)RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)累積及細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白1(chloride intracellular channel 1,CLIC1)表達(dá)的影響,探討GPs抗動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。[方法]將RAW264.7細(xì)胞接種于六孔板中,分為NC組、氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)組、GPs 10組、GPs 50組、GPs 100組及CLIC1 siRNA組。各組細(xì)胞處理24h后,油紅O染色檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的累積,化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol,TC)及游離膽固醇(free cholesterol,F(xiàn)C)的含量,熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)CLIC1、CD36 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá),免疫熒光技術(shù)觀察CLIC1的細(xì)胞定位,并用MQAE法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的變化。[結(jié)果]與NC組相比,ox-LDL組CLIC1、CD36 mRNA(P<0.01,P<0.001)及蛋白(P<0.01,P<0.001)表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞內(nèi)TC(P<0.001)、FC(P<0.01)顯著升高,細(xì)胞膜上CLIC1表達(dá)顯著升高,細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度顯著增加(P<0.01);經(jīng)CLIC1 siRNA或GPs處理后,細(xì)胞內(nèi)TC(P<0.001,P<0.001)、FC(P<0.01,P<0.01)含量降低,脂質(zhì)累積減少,CLIC1、CD36 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01,P<0.001)。[結(jié)論]CLIC1在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用,GPs可以通過(guò)調(diào)控CLIC1的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積。
GPs;CLIC1;巨噬細(xì)胞;總膽固醇;游離膽固醇;CD36 mRNA;脂質(zhì)累積;動(dòng)脈粥樣硬化
動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ),巨噬細(xì)胞攝取過(guò)多的脂質(zhì)而形成泡沫細(xì)胞是AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)和典型病理特征。凋亡的泡沫細(xì)胞不斷堆積可以形成動(dòng)脈壁脂肪條紋[1-2]。因而,抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積是抗AS研究的重要方向[3]。絞股藍(lán)總皂苷(gypenosides,GPs)是絞股藍(lán)最主要的生物活性成分,具有降血脂、抗炎、抗氧化的作用,能夠有效地保護(hù)心腦血管和肝臟[4-6]?,F(xiàn)有研究證實(shí),GPs能夠明顯降低AS動(dòng)物血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平,提高高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平[7-8]。在THP-1巨噬細(xì)胞中,GPs能降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的累積,抑制泡沫細(xì)胞的形成[9],但其機(jī)制尚未明確。
細(xì)胞內(nèi)氯離子通道蛋白1(chloride intracellular channel 1,CLIC1)是一種含241個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[10],廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi),參與了許多重要的生理過(guò)程,如細(xì)胞容量的調(diào)節(jié)、細(xì)胞器的酸化、細(xì)胞容積的穩(wěn)定、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞的增殖及分化[11]。CLIC1通常以可溶的形式存在于細(xì)胞質(zhì)及核漿內(nèi),在細(xì)胞氧化作用下其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,插入脂膜充當(dāng)氯離子選擇性通道[12-13]。已有研究表明,CLIC1在巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移能夠提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能[14]。
因此,本研究以RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,以氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積,觀察CLIC1在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積中的作用及GPs的調(diào)控機(jī)制。
1.1 細(xì)胞及主要試劑 RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,批號(hào):2017022705;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品公司,批號(hào):150208;油紅O粉劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,批號(hào):SLBH0251V;GPs購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(UV≥98%),批號(hào):J0423AS;總膽固醇檢測(cè)試劑盒及游離膽固醇試劑盒購(gòu)自北京普利萊生物科技有限公司,批號(hào)分別為:SJ-E1015、SJE1016;健康人血清購(gòu)于浙江省血液中心;CLIC1鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,批號(hào):L0815;CD36兔單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào):I8836-1-AP;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物有限公司,批號(hào)分別為:30147、10146、10146;氯離子熒光探針N-乙氧羰基甲基-6-甲氧基溴化喹啉(MQAE)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):0803171509;丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,批號(hào):20151223。
1.2 主要儀器 CP80MX超速離心機(jī),日本HITACHI公司;SpectraMax190酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices公司;3111 CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;PowerPacTMHCBIO-RAD電泳儀,美國(guó)Bio-Rad公司;5427R低溫高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;Stepone plus熒光定量PCR儀,美國(guó) ABI公司;JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝科器研究所;DMI8熒光顯微鏡,德國(guó)Leica公司。
2.1 ox-LDL的制備 取健康人血漿200mL,利用序列超速離心法分離脂蛋白,取密度為1.019~1.063g·L-1的部分,經(jīng) Saphrose 6B凝膠柱層析后得到純化的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)。純化后的 LDL,加入10μmol·L-1CuSO4氧化24h,而后加入10μmol·L-1的EDTA-2Na終止氧化。取少量氧化樣品,用MDA試劑盒測(cè)定LDL氧化程度。于含0.2% EDTA-2Na的PBS中透析除去 Cu2+,濃縮后即得ox-LDL,再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,BCA法測(cè)定濃度后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 RAW264.7細(xì)胞置于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中,于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),每隔2~3d傳代1次。將置于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞消化,計(jì)數(shù),每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中,分為NC組(正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞)、ox-LDL組(50μg·mL-1ox-LDL孵育RAW264.7細(xì)胞24h)、GPs 10組(10μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細(xì)胞24h)、GPs 50組(50 μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細(xì)胞24h)、GPs 100組(100μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7細(xì)胞24h)和CLIC1 siRNA組(RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染CLIC1 siRNA 12h后,50μg· mL-1ox-LDL孵育24h),再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.3 細(xì)胞內(nèi)TC及FC含量測(cè)定 細(xì)胞處理結(jié)束后,4°C、2 000r/min離心5min,收集各組細(xì)胞,以PBS沖洗3次,按照每106個(gè)細(xì)胞中加入0.1mL細(xì)胞裂解液的比例,在各組中加入細(xì)胞裂解液,離心后取上清液測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)TC和FC的含量并用BCA法測(cè)定上清液的蛋白濃度,以每mg蛋白濃度校正TC、FC的含量。膽固醇酯與TC比值 [(CE%)]=(TC-FC)/TC× 100%。具體操作按膽固醇檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
2.4 油紅O染色 細(xì)胞處理結(jié)束后,棄去各組培養(yǎng)液,以PBS洗3次,4%多聚甲醛固定30min,再以PBS洗3次后加入油紅O染液染色30min,最后用60%異丙醇洗1次,倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。
2.5 熒光定量PCR檢測(cè)CLIC1、CD36 mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA,并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如表1所示。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10min,95℃ 15s,60℃ 60s,40個(gè)循環(huán)。調(diào)整基線(xiàn)和閾值讀出各孔的循環(huán)數(shù)(Ct)。利用比較Ct法檢測(cè)各樣本CLIC1、CD36 mRNA的表達(dá)情況。倍增變化率=2-△△Ct(△△Ct=目的基因△Ct-內(nèi)參基因△Ct)。
2.6 免疫印跡法檢測(cè)泡沫細(xì)胞內(nèi)CLIC1、CD36蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理結(jié)束后,PBS洗3次,每孔加100 μL RIPA裂解液(含1μL PMSF),用刮刀將細(xì)胞刮下。轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,冰上裂解30min,4℃、12 000r/ min離心10min,取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2h,一抗4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜后二抗孵育2h,洗膜,化學(xué)顯影,分析各條帶灰度值。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequence
2.7 免疫熒光觀察CLIC1的細(xì)胞膜定位 將細(xì)胞接種于24×24mm蓋玻片上,每片接種2×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞處理完畢后,棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,4%多聚甲醛室溫固定15min,羊血清工作液37℃孵育60min。用PBS按說(shuō)明書(shū)的比例稀釋一抗,滴到細(xì)胞爬片表面,倒扣,37℃孵育2h,PBS洗3次,加入PBS稀釋的二抗,37℃避光孵育1h,PBS洗3次,DAPI染核15min,甘油封片,熒光顯微鏡下拍照觀察。
2.8 MQAE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度 將細(xì)胞接種于六孔板中,每孔2×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞處理完畢后,顯微鏡下計(jì)數(shù),各組取相同的細(xì)胞數(shù),離心,在含有5mmol·L-1MQAE的Krebs-HEPES緩沖液中37℃避光孵育1h,隨后用Krebs-HEPES緩沖液洗滌5次,進(jìn)行熒光測(cè)定,并在熒光顯微鏡下拍照觀察。
2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組之間比較采用t檢驗(yàn),大于兩組比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 GPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量的影響與NC組相比,50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)TC與FC含量明顯增加(P<0.001,P<0.01),CE(%)達(dá)到60%以上(P<0.01),說(shuō)明ox-LDL可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積,并轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞。與ox-LDL組 比較,50、100μg·mL-1GPs聯(lián) 合 處 理RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)TC含量(P<0.01,P<0.001)和CE(%)(P<0.05,P<0.01)均下降,說(shuō)明GPs可以降低巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量,抑制泡沫細(xì)胞形成。而CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達(dá)后,巨噬細(xì)胞內(nèi)TC(P<0.001)、FC(P<0.05)含量和CE(%)(P<0.01)也下調(diào),說(shuō)明CLIC1表達(dá)參與了巨噬細(xì)胞脂質(zhì)的積累。見(jiàn)表2。
表2 GPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)TC、FC的影響(±s,n=3)Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)
表2 GPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)TC、FC的影響(±s,n=3)Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)
注:與NC組比較,**P<0.01,***P<0.001;與ox-LDL組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。Note:Compared with NC group,**P<0.01,***P<0.001;compared with ox-LDL group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001.
組別 T C(μ m o l · g -1) F C(μ m o l · g -1) C E(%)N C組o x -L D L組G P s 1 0組G P s 5 0組G P s 1 0 0組C L I C 1 s i R N A組2 0 . 2 7 ± 1 . 3 1 8 1 . 6 0 ± 3 . 6 8 *** 7 2 . 0 4 ± 3 . 0 8 5 6 . 9 5 ± 1 . 8 9 ## 3 8 . 6 5 ± 2 . 6 5 ### 3 2 . 1 5 ± 2 . 4 5 ### 1 3 . 9 6 ± 0 . 9 2 2 6 . 5 5 ± 2 . 0 9 ** 2 5 . 3 0 ± 0 . 8 3 2 4 . 8 9 ± 0 . 8 0 1 9 . 3 7 ± 0 . 9 1 # 1 8 . 7 2 ± 0 . 8 0 # 3 0 . 6 9 ± 5 . 6 0 6 7 . 2 0 ± 3 . 4 8 ** 6 4 . 6 6 ± 2 . 6 2 5 5 . 5 0 ± 1 . 4 9 # 4 7 . 8 7 ± 2 . 2 2 ## 4 1 . 4 1 ± 2 . 6 5 ##
3.2 GPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響 如圖1所示,與NC組比較,ox-LDL作用RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)形成明顯的脂滴。與ox-LDL組比較,不同濃度的GPs處理組的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積減少,并具有一定的劑量效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系,說(shuō)明GPs可以減少RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)累積。此外,CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達(dá)后,ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中脂質(zhì)累積也明顯減少,說(shuō)明CLIC1可能是調(diào)控巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
圖1 GPs對(duì)RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響(油紅O染色,400×,標(biāo)尺50 μm)Fig.1 Effect of GPs on lipid accumulation in RAW264.7 cells(Oil red O stain,400×,bar 50 μm)
3.3 GPs對(duì)CLIC1、CD36 mRNA表達(dá)的影響 如表3所示,ox-LDL誘導(dǎo)后,RAW264.7細(xì)胞內(nèi)CLIC1(P<0.01)、CD36(P<0.001)mRNA的表達(dá)顯著升高;100 μg·mL-1GPs或CLIC1 siRNA處理后,ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)CLIC1(P<0.01,P<0.001)和CD36(P<0.001,P<0.001)mRNA表達(dá)量顯著下降。說(shuō)明CLIC1的干預(yù)可以抑制CD36的表達(dá),從而減少ox-LDL的攝入,而GPs可以通過(guò)調(diào)節(jié)CLIC1和CD36的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積,從而延緩AS的進(jìn)程。
表3 GPs對(duì)CLIC1、CD36 mRNA表達(dá)的影響Tab.3 Effects of GPs on expression of CLIC1 and CD36 mRNA
3.4 GPs對(duì)CLIC1和CD36蛋白表達(dá)的影響 免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明:ox-LDL可上調(diào)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)CLIC1(P<0.01)和CD36(P<0.001)蛋白表達(dá),而100 μg· mL-1GPs或CLIC1 siRNA可顯著降低細(xì)胞內(nèi)CLIC1(P<0.001,P<0.001)和CD36(P<0.01,P<0.01)蛋白表達(dá),此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)圖2。
3.5 GPs對(duì)CLIC1細(xì)胞定位的影響 50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞膜上CLIC1表達(dá)顯著升高,說(shuō)明ox-LDL可以促進(jìn)CLIC1的膜轉(zhuǎn)位。與ox-LDL組比較,CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達(dá)后,細(xì)胞膜上CLIC1表達(dá)顯著降低。此外,50 μg· mL-1ox-LDL與 50、100 μg·mL-1GPs聯(lián)合處理RAW264.7細(xì)胞后,CLIC1在細(xì)胞膜上的表達(dá)顯著降低,說(shuō)明GPs可以調(diào)控CLIC1的膜轉(zhuǎn)位,抑制氯離子通道的形成。見(jiàn)圖3。
3.6 GPs對(duì)細(xì)胞氯離子濃度的影響 50μg·mL-1ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度顯著升高(P<0.01)。CLIC1 siRNA抑制CLIC1表達(dá)后,氯離子濃度顯著降低(P<0.01)。與ox-LDL組比較,50、100 μg·mL-1GPs與ox-LDL聯(lián)合處理后,氯離子濃度顯著降低(P<0.01,P<0.01),說(shuō)明GPs可以降低氯離子濃度。見(jiàn)圖4。
圖2 GPs對(duì)CLIC1、CD36蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of GPs on expression of CLIC1 and CD36 protein
圖3 GPs對(duì)CLIC1的表達(dá)及細(xì)胞定位的影響(200×,標(biāo)尺100 μm)Fig.3 Effect of GPs on the expression and localization of CLIC1(200×,bar 100 μm)
絞股藍(lán)是葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)的根狀莖或全草,有千年藥用歷史,享有“南方人參”美譽(yù)[15]。其味甘苦、性寒,有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾之功效[16]。GPs是絞股藍(lán)最主要的生物活性成分,具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗AS的作用,能夠有效地保護(hù)心腦血管和肝臟。體內(nèi)研究表明,GPs能降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平,提高HDL-C水平[8],同時(shí)降低AS大鼠細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、MDA、LDL及主動(dòng)脈壁的細(xì)胞核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)水平,從而發(fā)揮抗AS的作用[17],但GPs抗AS的具體分子機(jī)制尚不清楚。
圖4 GPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的影響(200×,標(biāo)尺100 μm)Fig.4 Effect of GPs on intracellular Cl-concentration(200×,bar 100 μm)
AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)累積及細(xì)胞增殖等緊密相關(guān)[3,18]。已有研究證實(shí),脂質(zhì)在巨噬細(xì)胞中累積形成泡沫細(xì)胞的過(guò)程是AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞通過(guò)其表面的清道夫受體CD36攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞,凋亡的泡沫細(xì)胞不斷堆積,形成動(dòng)脈壁脂肪條紋[1-2]。因此,抑制脂質(zhì)的累積,減少泡沫細(xì)胞的形成,是減緩AS進(jìn)程的重要舉措。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,GPs能夠降低巨噬細(xì)胞中CD36基因的表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積,抑制泡沫細(xì)胞的形成[9]。在本研究中,GPs處理ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞后,CD36基因及蛋白水平表達(dá)降低,細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量降低,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積減少,說(shuō)明GPs可以抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積,這與前人的研究結(jié)果是一致的。
另外,現(xiàn)有的研究表明AS形成與紊亂的跨膜離子的運(yùn)動(dòng)如Ca2+、K+等密切相關(guān)[19-20],離子通道在離子的跨膜運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。而在巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL的過(guò)程中,離子通道是否發(fā)揮作用,目前尚不清楚。CLIC1作為細(xì)胞內(nèi)氯離子通道(chloride intracellular channel,CLIC)家族的一員,廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi),參與了許多重要的生理過(guò)程如細(xì)胞容量的調(diào)節(jié)、細(xì)胞器的酸化、細(xì)胞容積穩(wěn)定、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞的增殖及分化。并且,CLIC1最早從激活的巨噬細(xì)胞中克隆成功,其表達(dá)與亞細(xì)胞定位與巨噬細(xì)胞的吞噬功能密切相關(guān)。已有研究表明,CLIC1的膜轉(zhuǎn)移能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬體酸化,提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能[14]。同時(shí),在氧化物的刺激下,以可溶形式存在于細(xì)胞質(zhì)和核漿內(nèi)的CLIC1,可以發(fā)生改變并插入脂膜充當(dāng)氯離子選擇性通道。既然CLIC1與巨噬細(xì)胞吞噬作用有關(guān),而脂質(zhì)累積又是通過(guò)巨噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的,那么抑制CLIC1的表達(dá),則有可能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用,進(jìn)而抑制脂質(zhì)的累積。而在此過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度是否發(fā)生改變,目前尚不清楚。因而,本研究采用MQAE法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子的濃度,MQAE作為使用最廣泛的一種新型氯離子熒光探針,它以溴離子為配對(duì)陰離子,當(dāng)氯離子濃度升高時(shí),可置換出溴離子。因此,MQAE的熒光強(qiáng)度隨著氯離子濃度的增加而成比例地減少。本研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL能提高巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度,用CLIC1 siRNA或者不同濃度的GPs處理后,可以降低細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度的變化可能會(huì)與CLIC1膜轉(zhuǎn)移有關(guān),而GPs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度進(jìn)而調(diào)節(jié)CLIC1,從而影響巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的吞噬。
本研究發(fā)現(xiàn),ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后,CLIC1的mRNA及蛋白水平表達(dá)顯著升高,且在細(xì)胞膜上的表達(dá)升高,說(shuō)明在ox-LDL作用下,CLIC1呈現(xiàn)過(guò)表達(dá),并且向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移,從而說(shuō)明巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的過(guò)程伴隨著CLIC1的高表達(dá),證明二者存在著某些關(guān)聯(lián);而CLIC1 siRNA干擾后,CD36的表達(dá)顯著降低,細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量顯著降低,說(shuō)明CLIC1在巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用,抑制CLIC1可以降低CD36的表達(dá),從而降低ox-LDL的攝入。不同濃度的GPs作用后,CLIC1、CD36的表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量顯著降低,脂質(zhì)累積減少。說(shuō)明GPs可能通過(guò)調(diào)控CLIC1的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控清道夫受體CD36的水平,從而抑制巨噬細(xì)胞對(duì)ox-LDL的吞噬。
綜上所述,CLIC1在巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)累積中發(fā)揮著重要的作用,抑制CLIC1的表達(dá)可以降低巨噬細(xì)胞攝入ox-LDL。而GPs則能調(diào)控CLIC1的表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積,延緩AS的進(jìn)程,但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。
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Effect of Gypenosides Inhibiting the Accumulation of Lipid in Macrophage by Regulating CLIC1
ZONG Lei,REN Guangyan,HU Xiao,et alCollege of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)
[Objective]To study the effect of gypenosides(GPs)on the accumulation of lipid in RAW264.7 cells and the expression of intracellular chloride channel 1(CLIC1),and investigate the molecular mechanism of anti-atherosclerosis of GPs.[Methods]RAW264.7 cells were inoculated into 6-well plates and divided into NC group,ox-LDL group,GPs 10 group,GPs 50 group,GPs 100 group and CLIC1 siRNA group.After each group had been processed, the accumulation of lipid was detected by oil red O,the total cholesterol(TC)and free cholesterol(FC)in cells were measured by chemical method,the expression of CLIC1 and CD36 were measured with the technologies of qPCR and immunoblotting.Furthermore,immunofluorescence technique was used to observe the localization of CLIC1 and the method of MQAE was used to detect the change of chloride ion concentration.[Results]Compared with the NC group,CLIC1 and CD36 were significantly increased at the mRNA level(P<0.01,P<0.001)and protein level(P<0.01,P<0.001),the intracellular TC(P<0.001)and FC(P<0.01)were significantly increased,the CLIC1 expression on the cell membrane and the concentration of chloride ion were significantly increased(P<0.01)in the ox-LDL group;however,after treated with CLIC1 siRNA and different concentrations of GPs,intracellular TC(P<0.001,P<0.001),FC(P<0.01,P<0.01)content and lipid accumulation were decreased,CLIC1 and CD36 expression at the mRNA level and protein level were significantly reduced(P<0.01,P<0.001). [Conclusion]CLIC1 plays an important role in lipid accumulation of macrophage.GPs can inhibit accumulation of lipid by regulating CLIC1,and retard the progress of atherosclerosis.
gypenosides;CLIC1;macrophages;total cholesterol;free cholesterol;CD36 mRNA;lipid accumulation;atherosclerosis
R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1005-5509(2017)10-0777-07
10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.001
國(guó)家自然科學(xué)基金(81403133);浙江省自然科學(xué)基金(LQ14H280004,LY15H280005)
Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81403133);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LQ14H280004,LY15H280005)
盧德趙,E-mail:ludezhao@126.com
2017-06-15)