鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院（471000）董瑞強(qiáng) 張丹鳳 孫廣榮

腫瘤抑素所處的位置為IV型膠原α3鏈的C端非膠原區(qū)，其可以會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肺出血，以及腎小球腎炎。因此不能將其對(duì)人體進(jìn)行直接應(yīng)用[1]。本次研究的時(shí)間段為2016年1月～2016年6月，探討腫瘤抑素相關(guān)肽T42對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的抑制作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 研究材料 本次研究所選用的觀察對(duì)象為細(xì)胞，分組的方式為隨機(jī)分組，開(kāi)展的時(shí)間段為2016年1月～2016年6月，本次研究所采用的大腸桿菌來(lái)自SMELD公司，本次研究所采用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞是由我院樣本室自主保存，本次研究所采用的人胃腺癌中分化細(xì)胞株來(lái)自廣州生物研究所，本次研究所采用的T42表達(dá)載體的構(gòu)建工作是由本次研究人員共同來(lái)完成。

1.2 研究方法 腫瘤抑素相關(guān)肽T42的表達(dá)與純化：于大腸桿菌菌株中，將T42質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)，將單菌落進(jìn)行挑選，將其置于LB培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)基中含有氨芐青霉素，濃度為100mg/L，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩，保持溫度為37℃，第2d按照1∶50的比例，再次于LB培養(yǎng)基上接種，培養(yǎng)基含有氨芐青霉素，開(kāi)始震蕩30min，保持溫度為37℃，將IPTG加入，濃度為0.5mmol/L。繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，時(shí)間6h，保持溫度為28℃，之后開(kāi)展離心，時(shí)間10min，速度為每分鐘5000轉(zhuǎn)，離心完成后，對(duì)菌體進(jìn)行收集。于預(yù)冷的裂解緩沖液中將菌體重懸，超聲破菌后，離心，時(shí)間15min，速度每分鐘12000轉(zhuǎn)，提取上清液，注入幾丁質(zhì)親和柱。

細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)的方法選用MTT法進(jìn)行，對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其發(fā)展為對(duì)數(shù)期，采用胰酶進(jìn)行消化，開(kāi)展接種，使其位于96孔板，保持溫度為37℃，培養(yǎng)24h后，分6組，分別加T21肽，T19肽，T42肽，T19+T21肽，以及順鉑，上述物質(zhì)分別加不同濃度，對(duì)照組加磷酸鹽緩沖液，加液量同上述劑量相同，各濃度共包括6個(gè)復(fù)孔，終濃度為200，100，50，30，以及10mg/L。24h后，將MTT取20μL加入各孔中，孵育時(shí)間為4h，將孔內(nèi)培養(yǎng)液吸取干凈，之后在采用二甲基亞砜進(jìn)行添加，添加量為100μL，開(kāi)始振蕩，時(shí)間為10min，對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定。

蘇木精-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)：取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞，兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)期應(yīng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于24板孔，24h后，將終濃度為40mg/L的T42肽加入各孔，對(duì)照組加入磷酸鹽緩沖液，24h后，將蓋玻片取出，進(jìn)行處理，包括固定，漂洗，蘇木精-伊紅染色等，然后借助顯微鏡進(jìn)行觀察。

細(xì)胞遷移抑制實(shí)驗(yàn)：取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以及人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞，兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)期應(yīng)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于24板孔，直至其生長(zhǎng)覆蓋率超90%后，于孔板底部，采用移液器槍頭進(jìn)行劃痕，形成無(wú)細(xì)胞區(qū)，寬度約4mm，反復(fù)采用磷酸緩沖液進(jìn)行沖洗，之后采用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行重新加入，各細(xì)胞分3組，T42肽組，T19+T21肽半量聯(lián)合組，以及對(duì)照組，各組設(shè)復(fù)孔3個(gè)，于24h后，48h后觀察其遷移能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用±s來(lái)表示計(jì)量數(shù)據(jù)，行t檢驗(yàn)；用[例數(shù)(%)]來(lái)表示計(jì)數(shù)資料，行X2檢驗(yàn)；P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T42肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 T42肽不僅會(huì)抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)抑制人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞，同時(shí)這種抑制作用于劑量存在明顯的關(guān)系，前者的IC50為45mg/L，后者的IC50為51mg/L。如附表1、2所示。

附表1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率（%）

附表2 人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞存活率（%）

附表3 T42肽對(duì)兩種細(xì)胞遷移的抑制作用

2.2 T42肽對(duì)兩種細(xì)胞形態(tài)的影響 T42肽在產(chǎn)生作用達(dá)到24h之后，可以發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，同時(shí)上述兩種細(xì)胞同周圍的細(xì)胞發(fā)生分離，出現(xiàn)了皺縮，細(xì)胞的形狀呈現(xiàn)為卵圓形或圓形。

2.3 T42肽對(duì)兩種細(xì)胞遷移的抑制作用 采用T42肽作用于兩種細(xì)胞，使其發(fā)揮作用達(dá)到24h或是達(dá)到48h，結(jié)果都會(huì)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的遷移產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時(shí)這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯(lián)合使用差異并不明顯（P＞0.05）。如附表3。

3 討論

腫瘤抑素在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺滅時(shí)，不會(huì)對(duì)人體的正常細(xì)胞造成破壞，因此其不具有毒副作用。腫瘤抑素的功能區(qū)包括兩個(gè)，因此也就賦予了其具有的雙重抗腫瘤作用[2]。具有更為強(qiáng)烈的腫瘤抑制作用。加之該類物質(zhì)具有較高活性的抗血管作用，達(dá)到內(nèi)皮抑素的10倍，因此在采用其對(duì)機(jī)體進(jìn)行治療時(shí)，不需要大量用藥，小劑量即可。相應(yīng)的將治療成本有效降低，更有利于臨床應(yīng)用普及[3]。

腫瘤抑素發(fā)揮其具有的抗血管作用，主要是憑借其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，管狀化，以及細(xì)胞蛋白合成起到抑制作用，本次研究所采用的原核載體，有效地表達(dá)了目的基因，表達(dá)出的融合蛋白，其在上清液中，占到菌體蛋白的含量超過(guò)40%，加之采用幾丁質(zhì)親和層析柱，開(kāi)展純化，因此結(jié)果更為可靠有效。本次研究結(jié)果顯示，T42肽不僅會(huì)抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)抑制人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞，同時(shí)這種抑制作用與劑量存在明顯的關(guān)系，前者的IC50為45mg/L，后者的IC50為51mg/L。T42肽在產(chǎn)生作用達(dá)到24h之后，可以發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，同時(shí)上述兩種細(xì)胞同周圍的細(xì)胞發(fā)生分離，出現(xiàn)了皺縮，細(xì)胞的形狀呈現(xiàn)為卵圓形或圓形。采用T42肽進(jìn)行使用，使其發(fā)揮作用達(dá)到24h或是達(dá)到48h，都會(huì)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胃腺癌細(xì)胞的遷移產(chǎn)生明顯的抑制作用。同時(shí)這種抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量聯(lián)合使用差異并不明顯（P ＞0.05）。證實(shí)了T42肽可對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人SGC-7901胃腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移起到抑制作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮增殖發(fā)揮抑制作用，從而可能對(duì)血管生長(zhǎng)具有抑制作用。