葛金濤　吳秋月　劉興滿

摘要：銀杏聚戊烯醇是銀杏葉中重要的藥用、保健作用的有效成分，其主要以乙酸酯的形式存在，少量以游離醇的形式存在，在提取銀杏聚戊烯醇的過程中將聚戊烯乙酸酯水解為聚戊烯醇，可提高銀杏葉中聚戊烯醇的含量。在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優(yōu)化銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的工藝，以影響聚戊烯乙酸酯水解的料液比、時間、溫度為主要作用因子，采用高效液相色譜法（HPLC）測定聚戊烯醇含量，經(jīng)Design-Expert軟件分析數(shù)據(jù)，得到銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的最佳條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時間90 min、水解溫度37 ℃，在此最佳工藝組合條件下，銀杏雄株葉片中聚戊烯醇得率的實際測定值達1536%。

關鍵詞：銀杏雄株；聚戊烯乙酸酯；聚戊烯醇；響應面法；HPLC

中圖分類號： R2842文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0170-04

[HJ14mm]

收稿日期：2016-04-06

基金項目：江蘇省連云港市科技局農業(yè)科技攻關項目（編號：CN1301）。

作者簡介：葛金濤（1987—），男，山東濰坊人，碩士，助理研究員，主要從事果樹與觀賞樹木遺傳育種研究。E-mail：672643419@qqcom。

通信作者：吳秋月，碩士，農藝師，主要從事果樹與觀賞樹木遺傳育種研究。E-mail：709728218@qqcom。[HJ]

銀杏聚戊烯醇是由15～21個異戊烯單元構成的線性類脂化合物，具有重要的藥用和保健價值。研究表明，銀杏聚戊烯醇是人體多萜醇的結構類似物，是合成人體多萜醇及其衍生物的最佳中間體，代謝后可形成多萜醇以補充人體內多萜醇的不足，而多萜醇是人體生理活動不可缺少的元素之一，因此，銀杏聚戊烯醇具有重要的生理和藥用價值，可以提高人體的免疫功能、抑制癌細胞轉移[3]、促進肝細胞再生[4]以及增強膜的融合[5]等。

銀杏聚戊烯醇主要以乙酸酯（polyprenyl acetates，PPAs）的形式存在于銀杏葉片中，少量以游離醇（polyprenyl alcohols，PPs）的形式存在。因此，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析聚戊烯醇時，需對樣品進行水解處理，將PPAs轉變?yōu)镻Ps。水解采用的皂化劑一般有2種，一種是水-堿溶液，如NaOH-H2O、KOH-H2O等；另一種是醇-堿溶液，如NaOH-乙醇/甲醇等。Tateyama等采用濃度較高的KOH溶液在70 ℃以上進行水解[6-7]。Huh等采用弱堿K2CO3溶液水解，反應時間長達12 h[8]。楊克迪等采用5% NaOH甲醇溶液在常溫下水解樣品，聚戊烯乙酸酯完全水解的時間僅需25 h[9]。綜合前人的研究經(jīng)驗，本試驗采用5% NaOH甲醇溶液作為皂化劑，利用單因素試驗和響應面法（response surface methodology，RSM）探討料液比、水解時間及水解溫度3個影響因子及各影響因子之間的交互作用對銀杏雄株葉片中聚戊烯乙酸酯水解的影響規(guī)律，進而得到最佳的工藝組合。

1材料與方法

11試驗材料

銀杏（Ginkgo biloba L）葉片，于2011年9月取自揚州大學銀杏園內栽培管理一致的20株十三年生雄株，每株采集100片。采摘后洗凈，瀝干，105 ℃殺青，80 ℃烘干，粉碎過80目篩得銀杏葉粉末，置于-18 ℃密封保存。聚戊烯醇標準品（C90-Prenol），購自瑞典Larodan公司；水解用的石油醚、正己烷、乙酸乙酯，均為分析純，HPLC用的甲醇、異丙醇、正己烷為色譜純，200～300目硅膠，HPLC用水為超純水，其他用水為雙蒸水。

高效液相色譜儀（Shimadzu LC-10A），購自日本島津公司；紫外檢測器（SPD-10A），購自日本島津公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海森信實驗儀器有限公司；超聲波清洗器，購自江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機，購自湖南長沙平凡儀器儀表有限公司。

12銀杏葉聚戊烯醇提取液的制備

稱取3 g銀杏葉粉末進行超聲波提?。ㄕ和闉樘崛∪軇弦罕? g ∶12 mL，超聲時間60 min，溫度38 ℃），過濾得正己烷提取液，超聲波水解（皂化劑為5%氫氧化鈉甲醇溶液），取上層黃色澄清液體，旋轉蒸發(fā)，硅膠柱層析（洗脫液為石油醚和乙酸乙酯，體積比為9 ∶1，收集20 mL），蒸發(fā)至膏狀，溶于2 mL正己烷中，制備成聚戊烯醇提取液，即正已烷浸提液。

13聚戊烯醇標準曲線的繪制

131色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（150 mm×46 mm，5 μm），流動相：異丙醇、甲醇、正己烷、水，體積比為 50 ∶25 ∶10 ∶2，流速1 mL/min，于215 nm處檢測，柱溫 27 ℃，進樣量為10 μL。

132聚戊烯醇標準曲線的制作

研究發(fā)現(xiàn)，采用不同鏈長的聚戊烯醇標準品測試樣品，對樣品測試結果的相對標準誤差小于3%，在使用HPLC定量分析聚戊烯醇時，可以認為不同鏈長的聚戊烯醇對應的各色譜峰具有相同的響應因子[10]。因此，本試驗選取C90-Prenol作為外標物來建立聚戊烯醇HPLC的定量方法。

精確稱取20 mg C90-Prenol標準品，溶于100 mL正己烷中，得濃度為020 mg/mL的C90-Prenol標準液。分別吸取5、10、20、40 mL C90-Prenol標準液至50 mL容量瓶中，用正己烷定容，得002、004、008、016 mg/mL標準溶液，取各標準溶液進樣10 μL，測定其峰面積，得到聚戊烯醇標準曲線：y=5×10-7x-2950 6，r2=0998 7[11]。

133聚戊烯醇得率的計算

聚戊烯醇得率：y=[SX（][（s1+s2+s3）-B]×n×VA×m[SX）]×100%。

式中：s1、s2、s3分別為HPLC中C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面積；B為標準曲線回歸方程的截距；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積；A為標準曲線回歸方程的斜率；m為銀杏雄株葉片的質量[11]。

14單因素試驗

聚戊烯乙酸酯的水解為液-液兩相反應，本試驗采用超聲波，使兩相可以充分接觸，料液比、水解溫度和水解時間對聚戊烯乙酸酯的水解有很大的影響，因此，設計以料液比、水解時間、水解溫度為因子的單因素試驗，根據(jù)聚戊烯醇的得率，考察各因素對銀杏雄株葉片中聚戊烯乙酸酯水解的影響。在本試驗中，料液比是超聲提取得到的聚戊烯醇的正己烷浸提液和皂化劑的體積比，皂化劑采用5% NaOH-甲醇溶液。

141料液比對銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，設置正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液的體積比分別為1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5，在45 ℃下水解120 min，每個處理重復3次。

142水解時間對銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液料液比為1 g ∶3 mL、水解溫度為 45 ℃ 條件下分別水解60、 90、120、150、180 min，每個處理重復3次。

143水解溫度對銀杏雄株葉片聚戊烯乙酸酯水解的影響

準確稱取3 g銀杏雄株葉片粉末5份，根據(jù)“12”節(jié)中的試驗方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液與5% NaOH-甲醇溶液料液比為1 g ∶3 mL的條件下，分別在25、35、45、55、65 ℃水解溫度下水解120 min，每個處理重復3次。

15響應面優(yōu)化試驗

響應面優(yōu)化試驗采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理[12-13]，在單因素試驗的基礎上，為了獲取最佳的水解工藝條件，將影響聚戊烯乙酸酯水解較大的3個因素作為試驗因素進行優(yōu)化試驗，因素編碼及變量水平如表1所示。

2結果與分析

21單因素試驗結果與分析

211料液比對聚戊烯醇得率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，聚戊烯醇的得率總體呈增大的趨勢，當料液比為1 g ∶4 mL時，聚戊烯醇得率達到最大，繼續(xù)增大料液比，聚戊烯醇的得率無明顯變化。因此，確定銀杏葉中聚戊烯乙酸酯水解的最佳料液比為1 g ∶4 mL。

212水解時間對聚戊烯醇得率的影響

由圖2可知，隨著水解時間的延長，聚戊烯醇的得率呈先上升后下降的趨勢，當水解時間為90 min時，聚戊烯醇的得率達到最大值。聚戊烯乙酸酯的水解時間對聚戊烯醇的得率有明顯的影響，水解時間過短，聚戊烯乙酸酯不能完全水解，水解時間過長，可能會破壞聚戊烯醇的結構，導致聚戊烯醇的得率降低。因此，確定銀杏葉聚戊烯乙酸酯水解的最佳時間為90 min。

213水解溫度對聚戊烯醇得率的影響

由圖3可知，隨著水[CM（25]解溫度的上升，聚戊烯醇的得率逐漸增大，當水解溫度為

55 ℃時，聚戊烯醇的得率達到最大值，隨后繼續(xù)升高水解溫度，聚戊烯醇的得率反而下降，這是由于聚戊烯乙酸酯水解反應是一個吸熱的過程，水解溫度越高，越有利于聚戊烯乙酸酯水解，但是水解溫度過高，正己烷揮發(fā)加快，使得聚戊烯醇得率降低。因此，確定銀杏葉聚戊烯乙酸酯水解的最佳溫度為55 ℃。

22響應面優(yōu)化試驗結果與分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計，以料液比（A）、水解時間（B）和水解溫度（C）為自變量，以聚戊烯醇得率（Y）為響應值，設計了17組試驗，試驗設計及結果如表2所示。

221回歸模型建立及方差分析

采用Design-Expert軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析， 經(jīng)過擬合得到3個因素（A、B、C）與響應值（Y）之間的回歸方程為Y=1280-0069A+0120B-0330C-0063AB-2917×10-3AC+0190BC+0240A2-0350B2-0200C2，R2=0934，說明該回歸方程的擬合程度較好，試驗誤差小，能較好地分析和預測聚戊烯醇的得率隨水解條件變化而變化的情況，因此，可使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析[14-15]。

由表3可知，模型的F值為1107，P值為0002 3，表示該模型是極顯著的（P<001），各個試驗因素的F值和P值表示各因素對響應值的影響程度。綜合來看，在這個模型中，C、A2、B2有較高的顯著性（P<005），說明水解溫度對聚戊烯乙酸酯水解反應的影響最為顯著， 料液比、水解時間、水解

溫度對聚戊烯乙酸酯水解影響的顯著性表現(xiàn)為水解溫度>水解時間>料液比。

222因素間交互作用的分析

根據(jù)回歸方程利用 Design-Expert軟件作出不同影響因子的等高線，由圖4可知，水解時間與水解溫度的交互作用明顯，對聚戊烯乙酸酯水解的影響較為顯著；由圖5、圖6可知，料液比與水解時間、料液比與水解溫度之間的交互作用均不顯著。

利用Design-Expert軟件對回歸方程求解，得到聚戊烯乙酸酯水解的最佳方案，最佳條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時間9132 min、水解溫度3707 ℃，此時聚戊烯醇的理論最佳得率為1728%。

23最佳工藝參數(shù)組合驗證

為了進一步驗證該回歸模型的準確性和有效性， 按上述最優(yōu)水解組合進行聚戊烯乙酸酯水解反應[16-17]，同時考慮到實際操作，在料液比為1 g ∶3 mL、水解溫度為40 ℃、水解時間為95 min的條件下水解聚戊烯乙酸酯，重復3次。由表4可知，3組聚戊烯醇的得率均較高，平均值達到1536%，與理論預測值相比絕對誤差為0192%，說明在該最佳工藝參數(shù)組合條件下，聚戊烯乙酸酯的水解率較高。

3討論

響應面設計法是一種最優(yōu)化的統(tǒng)計學試驗設計方法，目前已廣泛應用于各種生物技術領域[15-16]。采用單因素試驗結合響應面設計法，對聚戊烯乙酸酯水解過程中的各因素進行了優(yōu)化，并建立了擬合度較高的數(shù)學模型，得出最佳水解條件為料液比1 g ∶3 mL、水解時間95 min、水解溫40 ℃，在此最佳工藝組合條件下，銀杏雄株葉片中聚戊烯醇的得率實際測定值可達1536%。

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