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        一種新獸用止瀉中藥復(fù)方制劑對(duì)大鼠的亞慢性毒性

        2017-10-27 13:12:58姜玲玲陳鴻宇史開志
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年16期

        姜玲玲 陳鴻宇 史開志

        摘要:為申報(bào)一種新獸用止瀉復(fù)方制劑,對(duì)其臨床用藥的安全性進(jìn)行了檢測(cè),對(duì)該復(fù)方制劑進(jìn)行了亞慢性毒性研究。采用80只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組,經(jīng)口給藥,劑量分別為3 000、1 500、750、0 mg/kg體質(zhì)量,連續(xù)灌胃30 d。試驗(yàn)期間觀察一般臨床狀況,每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量并據(jù)此調(diào)整染毒劑量。試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定試驗(yàn)動(dòng)物血常規(guī)、血清生化指標(biāo),并進(jìn)行病理解剖及病理組織學(xué)觀察。結(jié)果表明,除高劑量組個(gè)別大鼠心、肺、睪丸([XZ(15#]♂[XZ)])出現(xiàn)輕度瘀血外,其他各劑量組的實(shí)質(zhì)器官未發(fā)現(xiàn)異常變化;血液學(xué)指標(biāo)中除了高劑量組的嗜中性細(xì)胞絕對(duì)值水平顯著升高(P<005)和單核細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞比率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降(P<005)外,其余各組各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),與對(duì)照組無顯著差異。在本試驗(yàn)條件下,未發(fā)現(xiàn)該制劑對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響,短期重復(fù)應(yīng)用至少在1 500 mg/kg體質(zhì)量飼喂條件下無亞慢性毒性。

        關(guān)鍵詞:獸用中藥;多葉勾兒茶;復(fù)方制劑;大鼠;亞慢性毒性

        中圖分類號(hào): S85374文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

        文章編號(hào):1002-1302(2017)16-0148-04

        收稿日期:2016-04-07

        基金項(xiàng)目:貴州省重大專項(xiàng)(編號(hào):黔科合重大專項(xiàng)字[2013]6014);貴州省農(nóng)業(yè)類工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(編號(hào):黔科合農(nóng)G字[2015]4001);貴州省科技廳、貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合基金(編號(hào):黔科合LH字[2014]7701號(hào))。

        作者簡(jiǎn)介:姜玲玲(1987—),女,河南項(xiàng)城人,碩士,助理研究員,主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail:2056253464@qqcom。

        通信作者:卜仕金,博士,教授,從事獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究。E-mail:pushijin@aliyuncom。

        動(dòng)物腹瀉是集約化生產(chǎn)條件下一種典型的多因素性疾病,各種動(dòng)物均可發(fā)病,尤其見于仔豬、犢牛、羔羊等,給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。抗生素類藥物的治療不僅導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重,而且其殘留引起的畜產(chǎn)品質(zhì)量安全問題給社會(huì)帶來嚴(yán)重影響。中草藥以無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn),在疾病防治和高質(zhì)量的肉產(chǎn)品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。

        筆者所在課題組前輩根據(jù)中醫(yī)辯證施治理論,結(jié)合當(dāng)?shù)靥厣兴帯嗳~勾兒茶[1-2],對(duì)祖方改進(jìn)后,研制出以多葉勾兒茶為主,以地榆、烏藥等為輔的獸用止瀉新復(fù)方制劑,在臨床治療仔豬腹瀉、牛羊腹瀉中取得理想療效。結(jié)合前期工作,對(duì)該復(fù)方制劑毒理學(xué)進(jìn)行研究,為該復(fù)方制劑的推廣提供理論依據(jù)。

        1材料與方法

        11受試藥物

        止瀉復(fù)方制劑由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)研究室提供,按制劑臨床治療比例稀釋為1 mL含成品藥03 g,換算為生藥,1 mL含生藥13 g,棕褐色液體,氣味微苦。

        12試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)條件

        清潔級(jí)Wistar大鼠,由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,大鼠為4周齡、體質(zhì)量80~120 g,合格證號(hào):SCXK(蘇)2012-0004,使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2012-0004。試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房?jī)?nèi),室溫為(24±2) ℃,人工白晝24 h。

        13儀器

        電子天平(感量01 g)、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)刀等常規(guī)解剖器械;日立7150全自動(dòng)生化分析儀;Sysmex KX-21血細(xì)胞分析儀;光學(xué)顯微鏡;LeicaVT1000S手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī);HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱;其他病理學(xué)檢查常用儀器試劑等。

        14方法

        141染毒劑量及試驗(yàn)分組

        80只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和受試物高、中、低劑量組,每組20只,雌雄各半(雌雄分開飼養(yǎng),每籠飼養(yǎng)5只),組內(nèi)動(dòng)物個(gè)體體質(zhì)量相差不超過平均體質(zhì)量的10%,組間平均體質(zhì)量相差不超過5%。結(jié)合急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果,同時(shí)考慮亞慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)原則,各組染毒劑量分別為3 000、1 500、750 mg/kg體質(zhì)量,染毒時(shí)各組染毒體積控制在05~10 mL/100 g體質(zhì)量范圍內(nèi),對(duì)照組按 10 mL/100 g 體質(zhì)量經(jīng)口灌服潔凈自來水。30 d染毒試驗(yàn)采用經(jīng)口染毒,每天1次,連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d。試驗(yàn)期間每周定時(shí)稱體質(zhì)量,依據(jù)大鼠的體質(zhì)量變化調(diào)整染毒劑量。

        染毒期間每天觀察試驗(yàn)鼠健康狀況、采食及飲水變化。對(duì)出現(xiàn)異常的大鼠及時(shí)記錄、分析大鼠的中毒癥狀表現(xiàn)及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時(shí)間。每周稱體質(zhì)量和飼料各1次,并計(jì)算平均攝食量、增質(zhì)量及飼料轉(zhuǎn)化率(耗料/增質(zhì)量)。

        142檢測(cè)指標(biāo)

        最后一次染毒結(jié)束后撲殺所有大鼠,采用2%戊巴比妥鈉溶液以4 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血進(jìn)行血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測(cè)。血液學(xué)指標(biāo)包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞壓積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板(PLT)等。血液生化檢測(cè)包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLu)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血清鉀(K)、血清鈉(Na)、血清氯(Cl)、血清鈣(Ca)等。

        143病理檢查

        1431大體剖檢

        試驗(yàn)結(jié)束時(shí),對(duì)所有大鼠進(jìn)行剖檢,采用肉眼檢查。做好記錄,并將主要器官和組織用10%福爾馬林溶液固定保存,以備進(jìn)一步顯微檢查。

        1432臟器稱質(zhì)量

        在大體剖檢的同時(shí)稱取大鼠體質(zhì)量及各主要臟器(包括心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸、卵巢和子宮)的質(zhì)量并記錄。計(jì)算各臟器的相對(duì)質(zhì)量(臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值),即臟器系數(shù)。

        1433組織病理學(xué)檢查

        剖檢時(shí)先對(duì)高劑量組及對(duì)照組中所有大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。若發(fā)現(xiàn)高劑量組內(nèi)大鼠臟器出現(xiàn)明顯病變后,再對(duì)較低劑量組大鼠的相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。其中心、肝、肺、腎、脾、胃、睪丸及卵巢和子宮的組織病理學(xué)檢查為必測(cè)項(xiàng)目。

        15數(shù)據(jù)處理

        各處理組數(shù)據(jù)以x[TX-5]±s表示。用SPSS應(yīng)用軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)。采用t-檢驗(yàn)比較試驗(yàn)組與對(duì)照組間增質(zhì)量、臟器系數(shù)、血液生化等指標(biāo)的顯著性分析。

        [BT1-5][STHZ]2結(jié)果

        21臨床表現(xiàn)

        各組大鼠連續(xù)灌服染毒30 d期間,各處理組中大鼠臨床表現(xiàn)正常。試驗(yàn)期間復(fù)方制劑對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,各處理組中雌雄大鼠體質(zhì)量變化無明顯差異(P>005)。

        注:同行數(shù)據(jù)各試驗(yàn)組與對(duì)照組分別進(jìn)行t-檢驗(yàn)(雙尾檢驗(yàn)),n=10,“”表示P<005,差異顯著;“”表示P<001,差異極顯著。下表同。

        22血液學(xué)及血清生化指標(biāo)

        大鼠連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d后,各組血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與對(duì)照組相比,復(fù)方制劑高劑量組嗜中性細(xì)胞絕對(duì)值水平明顯升高(P<005);單核細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降(P<005)。復(fù)方制劑中、低劑量組血液生化指標(biāo)變化不顯著(P>005)。

        大鼠連續(xù)染毒30 d后,各組血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與對(duì)照組相比,復(fù)方制劑高劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶水平顯著升高(P<005)。

        23臟器系數(shù)

        大鼠連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d后,各組臟器系數(shù)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表4。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與對(duì)照組相比,復(fù)方制劑高劑量組雌鼠的肝、腎的臟器系數(shù)水平明顯升高(P<005)。

        24病理學(xué)變化

        對(duì)經(jīng)口連續(xù)灌服染毒30 d后宰殺的大鼠剖檢后,對(duì)照組中所有大鼠經(jīng)肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變,對(duì)照組所有大鼠的心、肝、腎、脾、肺、胃、睪丸([XZ(15#]♂[XZ)])及子宮(♀)等組織進(jìn)行的組織病理學(xué)切片檢查,均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變,表明30 d染毒試驗(yàn)飼養(yǎng)條件控制符合要求。高劑量組中所有大鼠經(jīng)肉眼觀察亦均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變,對(duì)高劑量組所有大鼠的心、肝、腎、脾、肺、胃、睪丸([XZ(15#]♂[XZ)])及子宮(♀)等組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片檢查,除高劑量組個(gè)別大鼠心(圖1、圖2)、肺(圖3、圖4)、睪丸([XZ(15#]♂[XZ)])(圖5、圖6)出現(xiàn)輕度瘀血外,各劑量組中的大鼠肝、腎、心、脾和肺等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

        3討論與分析

        本中藥復(fù)方制劑是由獲得國(guó)家發(fā)明專利技術(shù)成果“一種獸用止瀉中藥制劑及其制備方法”進(jìn)行熟化與轉(zhuǎn)化而得,主要針對(duì)動(dòng)物腹瀉下痢,臨床療效穩(wěn)定,本研究參照《中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性指導(dǎo)原則》[4],連續(xù)給藥1個(gè)月,旨在觀察Wistar大鼠長(zhǎng)期灌胃該制劑提取液后可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性效應(yīng)關(guān)系,找出無毒反應(yīng)劑量,為臨床使用劑量和主要觀察指標(biāo)等提供參考依據(jù)。

        亞慢性毒性試驗(yàn)是指在試驗(yàn)動(dòng)物部分生存期內(nèi),每天反復(fù)接觸受試物后在一定時(shí)期內(nèi)所引起的不良反應(yīng)。本試驗(yàn)通過觀察灌胃藥物后大鼠的臨床表現(xiàn)、血液學(xué)、生化指標(biāo)及組織切片等幾個(gè)方面試驗(yàn)來考察復(fù)方制劑的毒性。各組大鼠連續(xù)灌服染毒30 d期間,各組大鼠臨床表現(xiàn)正常,與空白對(duì)照組比較復(fù)方制劑各劑量組大鼠體質(zhì)量無明顯變化,說明對(duì)大鼠的正常生長(zhǎng)無影響。

        血液學(xué)及血清生化指標(biāo)是毒理學(xué)試驗(yàn)中經(jīng)常用于測(cè)評(píng)的指標(biāo),通過衡量機(jī)體血液成分在受試藥物作用下有無改變,從而[CM(25]確定受試藥物的毒性大小[8]。本試驗(yàn)血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示,復(fù)方制劑中、低劑量組與對(duì)照組均無顯著差異;高劑量嗜中性細(xì)胞絕對(duì)值水平顯著升高(P<005);單核細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降(P<005);但缺乏劑量相關(guān)性,臨床意義不大。血清生化指標(biāo)中、低劑量組與對(duì)照組均無顯著性差異,高劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著升高(P<005)。AST、ALT、LDH是用來評(píng)價(jià)肝損傷的重要血清酶指標(biāo)[9-11],血清酶檢查的基本原理在于肝損害時(shí)酶由細(xì)胞內(nèi)大量釋放入血,導(dǎo)致血清中的含量升高[12]。齊云等報(bào)道SPF級(jí)11周齡Wistar雄性大鼠AST值為(1517±133) U/L,雌性大鼠為(1966±245) U/L;詹純列等也報(bào)道普通級(jí)Wistar大鼠AST為(315±134) U/L,SPF級(jí)大鼠為(324±238) U/L[14]。本試驗(yàn)高劑量組AST指標(biāo)(14450±1856) U/L雖然高于對(duì)照組,但組織學(xué)觀察無明顯異常,且數(shù)值在正常范圍值以內(nèi)。LDH常作為心肌異常診斷的參數(shù),結(jié)合組織病理學(xué)切片檢查發(fā)現(xiàn)高劑量組中1/5大鼠心臟出現(xiàn)輕度瘀血,而LDH偏高可能與其心臟組織輕度瘀血有關(guān),表明復(fù)方制劑高劑量可能對(duì)大鼠的心臟有影響。

        臟器系數(shù)和病理學(xué)檢測(cè)顯示,中、低劑量組與對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變,高劑量組雌鼠的肝、腎的臟器系數(shù)

        顯著高于對(duì)照組(P<005),但這2個(gè)組織的組織病理學(xué)檢查未見明顯異常,表明連續(xù)給藥30 d對(duì)上述組織尚無實(shí)質(zhì)性的影響,這可能與給藥時(shí)間較短,且藥物對(duì)臟器功能的影響往往先于形態(tài)學(xué)的影響有關(guān),更長(zhǎng)時(shí)間給藥是否會(huì)導(dǎo)致肝臟和腎臟的形態(tài)學(xué)改變還有待進(jìn)一步研究。組織病理學(xué)切片檢查中,除高劑量組個(gè)別大鼠心、肺、睪丸出現(xiàn)輕度瘀血外,各劑量組中的大鼠肝、腎、心、脾和肺等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

        4小結(jié)

        亞慢性毒性試驗(yàn)顯示,中、低劑量組大鼠血液學(xué)及血清生化指標(biāo)和臟器組織與對(duì)照組無顯著性差異,綜合分析,該制劑中劑量組對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育未產(chǎn)生影響,短期重復(fù)應(yīng)用至少在1 500 mg/kg飼喂條件下無亞慢性毒性。

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