姜玲玲　陳鴻宇　史開志

摘要：為申報一種新獸用止瀉復(fù)方制劑，對其臨床用藥的安全性進(jìn)行了檢測，對該復(fù)方制劑進(jìn)行了亞慢性毒性研究。采用80只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，經(jīng)口給藥，劑量分別為3 000、1 500、750、0 mg/kg體質(zhì)量，連續(xù)灌胃30 d。試驗期間觀察一般臨床狀況，每周測量大鼠體質(zhì)量并據(jù)此調(diào)整染毒劑量。試驗結(jié)束后測定試驗動物血常規(guī)、血清生化指標(biāo)，并進(jìn)行病理解剖及病理組織學(xué)觀察。結(jié)果表明，除高劑量組個別大鼠心、肺、睪丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）出現(xiàn)輕度瘀血外，其他各劑量組的實質(zhì)器官未發(fā)現(xiàn)異常變化；血液學(xué)指標(biāo)中除了高劑量組的嗜中性細(xì)胞絕對值水平顯著升高（P<005）和單核細(xì)胞絕對值、單核細(xì)胞比率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降（P<005）外，其余各組各項指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，與對照組無顯著差異。在本試驗條件下，未發(fā)現(xiàn)該制劑對大鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，短期重復(fù)應(yīng)用至少在1 500 mg/kg體質(zhì)量飼喂條件下無亞慢性毒性。

關(guān)鍵詞：獸用中藥；多葉勾兒茶；復(fù)方制劑；大鼠；亞慢性毒性

中圖分類號： S85374文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0148-04

收稿日期：2016-04-07

基金項目：貴州省重大專項（編號：黔科合重大專項字[2013]6014）；貴州省農(nóng)業(yè)類工程技術(shù)研究中心項目（編號：黔科合農(nóng)G字[2015]4001）；貴州省科技廳、貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合基金（編號：黔科合LH字[2014]7701號）。

作者簡介：姜玲玲（1987—），女，河南項城人，碩士，助理研究員，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：2056253464@qqcom。

通信作者：卜仕金，博士，教授，從事獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究。E-mail：pushijin@aliyuncom。

動物腹瀉是集約化生產(chǎn)條件下一種典型的多因素性疾病，各種動物均可發(fā)病，尤其見于仔豬、犢牛、羔羊等，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失?？股仡愃幬锏闹委煵粌H導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重，而且其殘留引起的畜產(chǎn)品質(zhì)量安全問題給社會帶來嚴(yán)重影響。中草藥以無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、價格便宜等優(yōu)點，在疾病防治和高質(zhì)量的肉產(chǎn)品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。

筆者所在課題組前輩根據(jù)中醫(yī)辯證施治理論，結(jié)合當(dāng)?shù)靥厣兴帯嗳~勾兒茶[1-2]，對祖方改進(jìn)后，研制出以多葉勾兒茶為主，以地榆、烏藥等為輔的獸用止瀉新復(fù)方制劑，在臨床治療仔豬腹瀉、牛羊腹瀉中取得理想療效。結(jié)合前期工作，對該復(fù)方制劑毒理學(xué)進(jìn)行研究，為該復(fù)方制劑的推廣提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11受試藥物

止瀉復(fù)方制劑由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)研究室提供，按制劑臨床治療比例稀釋為1 mL含成品藥03 g，換算為生藥，1 mL含生藥13 g，棕褐色液體，氣味微苦。

12試驗動物及試驗條件

清潔級Wistar大鼠，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，大鼠為4周齡、體質(zhì)量80～120 g，合格證號：SCXK（蘇）2012-0004，使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0004。試驗動物飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心動物房內(nèi)，室溫為（24±2） ℃，人工白晝24 h。

13儀器

電子天平（感量01 g）、灌胃針、手術(shù)剪、手術(shù)刀等常規(guī)解剖器械；日立7150全自動生化分析儀；Sysmex KX-21血細(xì)胞分析儀；光學(xué)顯微鏡；LeicaVT1000S手動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱；其他病理學(xué)檢查常用儀器試劑等。

14方法

141染毒劑量及試驗分組

80只大鼠隨機(jī)分成對照組和受試物高、中、低劑量組，每組20只，雌雄各半（雌雄分開飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)5只），組內(nèi)動物個體體質(zhì)量相差不超過平均體質(zhì)量的10%，組間平均體質(zhì)量相差不超過5%。結(jié)合急性毒性試驗的結(jié)果，同時考慮亞慢性毒性試驗的劑量設(shè)計原則，各組染毒劑量分別為3 000、1 500、750 mg/kg體質(zhì)量，染毒時各組染毒體積控制在05～10 mL/100 g體質(zhì)量范圍內(nèi)，對照組按 10 mL/100 g 體質(zhì)量經(jīng)口灌服潔凈自來水。30 d染毒試驗采用經(jīng)口染毒，每天1次，連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d。試驗期間每周定時稱體質(zhì)量，依據(jù)大鼠的體質(zhì)量變化調(diào)整染毒劑量。

染毒期間每天觀察試驗鼠健康狀況、采食及飲水變化。對出現(xiàn)異常的大鼠及時記錄、分析大鼠的中毒癥狀表現(xiàn)及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時間。每周稱體質(zhì)量和飼料各1次，并計算平均攝食量、增質(zhì)量及飼料轉(zhuǎn)化率（耗料/增質(zhì)量）。

142檢測指標(biāo)

最后一次染毒結(jié)束后撲殺所有大鼠，采用2%戊巴比妥鈉溶液以4 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉后經(jīng)腹主動脈采血進(jìn)行血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測。血液學(xué)指標(biāo)包括白細(xì)胞計數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞壓積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板（PLT）等。血液生化檢測包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血糖（GLu）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、血清鉀（K）、血清鈉（Na）、血清氯（Cl）、血清鈣（Ca）等。

143病理檢查

1431大體剖檢

試驗結(jié)束時，對所有大鼠進(jìn)行剖檢，采用肉眼檢查。做好記錄，并將主要器官和組織用10%福爾馬林溶液固定保存，以備進(jìn)一步顯微檢查。

1432臟器稱質(zhì)量

在大體剖檢的同時稱取大鼠體質(zhì)量及各主要臟器（包括心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸、卵巢和子宮）的質(zhì)量并記錄。計算各臟器的相對質(zhì)量（臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值），即臟器系數(shù)。

1433組織病理學(xué)檢查

剖檢時先對高劑量組及對照組中所有大鼠的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。若發(fā)現(xiàn)高劑量組內(nèi)大鼠臟器出現(xiàn)明顯病變后，再對較低劑量組大鼠的相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。其中心、肝、肺、腎、脾、胃、睪丸及卵巢和子宮的組織病理學(xué)檢查為必測項目。

15數(shù)據(jù)處理

各處理組數(shù)據(jù)以x[TX-5]±s表示。用SPSS應(yīng)用軟件進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗。采用t-檢驗比較試驗組與對照組間增質(zhì)量、臟器系數(shù)、血液生化等指標(biāo)的顯著性分析。

[BT1-5][STHZ]2結(jié)果

21臨床表現(xiàn)

各組大鼠連續(xù)灌服染毒30 d期間，各處理組中大鼠臨床表現(xiàn)正常。試驗期間復(fù)方制劑對大鼠生長發(fā)育的影響結(jié)果見表1。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，各處理組中雌雄大鼠體質(zhì)量變化無明顯差異（P>005）。

注：同行數(shù)據(jù)各試驗組與對照組分別進(jìn)行t-檢驗（雙尾檢驗），n=10，“”表示P<005，差異顯著；“”表示P<001，差異極顯著。下表同。

22血液學(xué)及血清生化指標(biāo)

大鼠連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d后，各組血液學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果見表2。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與對照組相比，復(fù)方制劑高劑量組嗜中性細(xì)胞絕對值水平明顯升高（P<005）；單核細(xì)胞絕對值、單核細(xì)胞率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降（P<005）。復(fù)方制劑中、低劑量組血液生化指標(biāo)變化不顯著（P>005）。

大鼠連續(xù)染毒30 d后，各組血清生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與對照組相比，復(fù)方制劑高劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶水平顯著升高（P<005）。

23臟器系數(shù)

大鼠連續(xù)經(jīng)口灌服染毒30 d后，各組臟器系數(shù)指標(biāo)測定結(jié)果見表4。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與對照組相比，復(fù)方制劑高劑量組雌鼠的肝、腎的臟器系數(shù)水平明顯升高（P<005）。

24病理學(xué)變化

對經(jīng)口連續(xù)灌服染毒30 d后宰殺的大鼠剖檢后，對照組中所有大鼠經(jīng)肉眼觀察均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變，對照組所有大鼠的心、肝、腎、脾、肺、胃、睪丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）及子宮（♀）等組織進(jìn)行的組織病理學(xué)切片檢查，均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變，表明30 d染毒試驗飼養(yǎng)條件控制符合要求。高劑量組中所有大鼠經(jīng)肉眼觀察亦均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變，對高劑量組所有大鼠的心、肝、腎、脾、肺、胃、睪丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）及子宮（♀）等組織進(jìn)行組織病理學(xué)切片檢查，除高劑量組個別大鼠心（圖1、圖2）、肺（圖3、圖4）、睪丸（[XZ（15#]♂[XZ）]）（圖5、圖6）出現(xiàn)輕度瘀血外，各劑量組中的大鼠肝、腎、心、脾和肺等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

3討論與分析

本中藥復(fù)方制劑是由獲得國家發(fā)明專利技術(shù)成果“一種獸用止瀉中藥制劑及其制備方法”進(jìn)行熟化與轉(zhuǎn)化而得，主要針對動物腹瀉下痢，臨床療效穩(wěn)定，本研究參照《中藥、天然藥物長期毒性指導(dǎo)原則》[4]，連續(xù)給藥1個月，旨在觀察Wistar大鼠長期灌胃該制劑提取液后可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、毒性效應(yīng)關(guān)系，找出無毒反應(yīng)劑量，為臨床使用劑量和主要觀察指標(biāo)等提供參考依據(jù)。

亞慢性毒性試驗是指在試驗動物部分生存期內(nèi)，每天反復(fù)接觸受試物后在一定時期內(nèi)所引起的不良反應(yīng)。本試驗通過觀察灌胃藥物后大鼠的臨床表現(xiàn)、血液學(xué)、生化指標(biāo)及組織切片等幾個方面試驗來考察復(fù)方制劑的毒性。各組大鼠連續(xù)灌服染毒30 d期間，各組大鼠臨床表現(xiàn)正常，與空白對照組比較復(fù)方制劑各劑量組大鼠體質(zhì)量無明顯變化，說明對大鼠的正常生長無影響。

血液學(xué)及血清生化指標(biāo)是毒理學(xué)試驗中經(jīng)常用于測評的指標(biāo)，通過衡量機(jī)體血液成分在受試藥物作用下有無改變，從而[CM（25]確定受試藥物的毒性大小[8]。本試驗血液學(xué)指標(biāo)結(jié)果顯示，復(fù)方制劑中、低劑量組與對照組均無顯著差異；高劑量嗜中性細(xì)胞絕對值水平顯著升高（P<005）；單核細(xì)胞絕對值、單核細(xì)胞率、紅細(xì)胞壓積水平顯著下降（P<005）；但缺乏劑量相關(guān)性，臨床意義不大。血清生化指標(biāo)中、低劑量組與對照組均無顯著性差異，高劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）水平顯著升高（P<005）。AST、ALT、LDH是用來評價肝損傷的重要血清酶指標(biāo)[9-11]，血清酶檢查的基本原理在于肝損害時酶由細(xì)胞內(nèi)大量釋放入血，導(dǎo)致血清中的含量升高[12]。齊云等報道SPF級11周齡Wistar雄性大鼠AST值為（1517±133） U/L，雌性大鼠為（1966±245） U/L；詹純列等也報道普通級Wistar大鼠AST為（315±134） U/L，SPF級大鼠為（324±238） U/L[14]。本試驗高劑量組AST指標(biāo)（14450±1856） U/L雖然高于對照組，但組織學(xué)觀察無明顯異常，且數(shù)值在正常范圍值以內(nèi)。LDH常作為心肌異常診斷的參數(shù)，結(jié)合組織病理學(xué)切片檢查發(fā)現(xiàn)高劑量組中1/5大鼠心臟出現(xiàn)輕度瘀血，而LDH偏高可能與其心臟組織輕度瘀血有關(guān)，表明復(fù)方制劑高劑量可能對大鼠的心臟有影響。

臟器系數(shù)和病理學(xué)檢測顯示，中、低劑量組與對照組均未發(fā)現(xiàn)任何異常和可疑病變，高劑量組雌鼠的肝、腎的臟器系數(shù)

顯著高于對照組（P<005），但這2個組織的組織病理學(xué)檢查未見明顯異常，表明連續(xù)給藥30 d對上述組織尚無實質(zhì)性的影響，這可能與給藥時間較短，且藥物對臟器功能的影響往往先于形態(tài)學(xué)的影響有關(guān)，更長時間給藥是否會導(dǎo)致肝臟和腎臟的形態(tài)學(xué)改變還有待進(jìn)一步研究。組織病理學(xué)切片檢查中，除高劑量組個別大鼠心、肺、睪丸出現(xiàn)輕度瘀血外，各劑量組中的大鼠肝、腎、心、脾和肺等組織亦均未發(fā)現(xiàn)異常的組織病理學(xué)變化。

4小結(jié)

亞慢性毒性試驗顯示，中、低劑量組大鼠血液學(xué)及血清生化指標(biāo)和臟器組織與對照組無顯著性差異，綜合分析，該制劑中劑量組對大鼠的生長發(fā)育未產(chǎn)生影響，短期重復(fù)應(yīng)用至少在1 500 mg/kg飼喂條件下無亞慢性毒性。

參考文獻(xiàn)：

多葉勾兒茶、慶豐霉素治療仔豬白痢[J] 農(nóng)業(yè)科技簡報，1979（12）：33

梁應(yīng)林，李仲佰，楊茂生 貴州止瀉草藥對預(yù)防仔豬腹瀉效果的影響[J] 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（22）：5535-5538

[3]鄭筱萸 化學(xué)藥品和治療用生物制品研究指導(dǎo)原則（試行）[M] 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002

[4]農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編（2006—2011年）[M]北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：84-87

[5]陳奇 中藥藥理研究方法學(xué)[M] 北京：人民衛(wèi)生出版社，1993

[6]郭迎春，邸靜，胡松華，等 人參葉口服液對大鼠的亞慢性毒性試驗[J] 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（5）：59-63

[7]李勝坤，王勝義，崔東安，等 烏錦顆粒劑的急性毒性與亞慢性毒性試驗研究[J] 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（5）：1203-1210

[8]劉霆，陳玉祥，趙顏忠，等 銀杏內(nèi)酯軟膠囊毒理學(xué)研究[J] 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13（6）：24-27

[9]唐嬌，趙敏，譚劍斌，等 三七的經(jīng)口急性毒性及亞慢性毒性研究[J] 華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，41（6）：521-526

[10]Hor S Y，Ahmad M，F(xiàn)arsi E，et al Acute and subchronic oral toxicity of Coriolus versicolor standardized water extract in Sprague-Dawley rats[J] Journal of Ethnopharmacology，2011，137（3）：1067-1076

[11]Ihsan A，Wang X，Huang X J，et al Acute and subchronic toxicological evaluation of Mequindox in Wistar rats[J] Regulatory Toxicology and Pharmacology，2010，57（2/3）：307-314

[12]譚毓治 藥物毒理學(xué)[M] 北京：科學(xué)出版社，2010

[13]齊云，蔡潤蘭，王敏，等 新藥長毒試驗動物血液生化測定規(guī)化研究系列之六——SPF級Wistar大鼠血液生化參考值的建立[J] 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006（4）：197-200

[14]詹純列，肖育華，李新春，等 普通級、SPF級SD、Wistar大鼠血液生化常值的測定與比較[J] 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004（2）：94-97