周霞　張堯　張成霞

摘要：研究了菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、酶系統(tǒng)、酶解時(shí)間等條件對(duì)荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備的影響，通過(guò)紫外線誘變技術(shù)篩選得到1株高產(chǎn)多糖的菌株。結(jié)果表明，原生質(zhì)體制備最適菌齡為4 d，滲透壓穩(wěn)定劑為06 mol/L甘露醇，使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合在30 ℃酶解25 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)138×107個(gè)/mL，再生率為127%。經(jīng)誘變、篩選和遺傳穩(wěn)定性分析，獲得1株多糖含量較出發(fā)菌株提高3449%的突變菌株。

關(guān)鍵詞：荷葉離褶傘；原生質(zhì)體；紫外誘變；多糖

中圖分類(lèi)號(hào)： S6461036文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0126-03

收稿日期：2017-02-27

基金項(xiàng)目：江蘇省泰州市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：TN201514）。

作者簡(jiǎn)介：周霞（1983—），女，江蘇泰州人，碩士，講師，主要從事園林園藝專(zhuān)業(yè)的遺傳育種、栽培和食用菌栽培等教學(xué)與科研。Tel：（0523）86158388；E-mail：694416747@qqcom。

荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes），隸屬于傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）離褶傘屬（Lyophyllum），是一種十分珍貴的野生食藥兼用菌，它口感鮮美，富含豐富的礦物質(zhì)、維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。鹿茸菇為其商品名，是由于它的菌傘酷似我國(guó)名貴的中藥材鹿茸切片而得名，除了外觀與鹿茸相似外，據(jù)國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，它還具有多重藥用功效。多糖是荷葉離褶傘的主要有效成分，目前正成為國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[6-8]。本研究通過(guò)紫外線誘變?cè)|(zhì)體技術(shù)[9-12]選育出高產(chǎn)多糖的荷葉離褶傘菌株。

1材料與方法

11材料

111菌種荷葉離褶傘供試菌種（中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)CGMCC No1518，菌株號(hào)ZY48-1，專(zhuān)利號(hào)：ZL2005100964050。）

112培養(yǎng)基菌絲固體培養(yǎng)基（PDA）、菌絲液體培養(yǎng)基（PGA）、原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、K2HPO4 15 g、MgSO4·7H2O 15 g、瓊脂2%、水1 000 mL、06 mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑）。

12試驗(yàn)方法

121菌絲體培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線

刮取培養(yǎng)好的斜面菌種放入盛有10 mL無(wú)菌水的小三角瓶中，內(nèi)置碎玻璃，充分振蕩，吸取2 mL菌絲懸液于盛有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)數(shù)天。3次重復(fù)，每隔1 d將菌絲體于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，繪制生長(zhǎng)曲線。

122原生質(zhì)體制備

將培養(yǎng)好的菌絲置于離心管中，4 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，用穩(wěn)滲劑洗滌3 次，按200 mg/mL比例加入酶液，30 ℃酶解數(shù)小時(shí)，得純化原生質(zhì)體，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌條件下進(jìn)行，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)計(jì)算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

123原生質(zhì)體制備條件

在同等條件下分別研究酶系統(tǒng)、酶解時(shí)間、滲透壓穩(wěn)定劑種類(lèi)、菌齡等條件對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。酶系統(tǒng)：2%溶壁酶、2%纖維素酶、2%蝸牛酶、1%溶壁酶+1%纖維素酶、1%溶壁酶+1%蝸牛酶、1%纖維素酶+1%蝸牛酶。酶解時(shí)間為1、2、3、4、5 h。滲透壓穩(wěn)定劑：06 mol/L 的硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、葡萄糖。菌齡：分別取菌齡2、4、6、8、10、12 d的菌絲體制備原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)。

124原生質(zhì)體再生

用滲透壓穩(wěn)定劑將純化的原生質(zhì)體稀釋并涂布原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基平板，25 ℃培養(yǎng)，8～10 d后觀察原生質(zhì)體的再生情況。同時(shí)用無(wú)菌水漲破原生質(zhì)體后作為對(duì)照，消除非原生質(zhì)體所形成的菌落帶來(lái)的誤差。

125原生質(zhì)體紫外線誘變

無(wú)菌條件下，將制備好的原生質(zhì)體稀釋至104個(gè)/mL，取5 mL于9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用磁力攪拌器使原生質(zhì)體懸液保持均勻。在預(yù)熱穩(wěn)定的15 W紫外燈下距離30 cm處分別照射0、10、20、30、40、50、60、80、100 s，每組2個(gè)重復(fù)。吸取原生質(zhì)體懸液200 μL，涂布再生培養(yǎng)基，25 ℃避光培養(yǎng)，計(jì)菌落數(shù)，繪制荷葉離褶傘原生質(zhì)體紫外線誘變劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算原生質(zhì)體紫外線誘變的半致死劑量，并確定誘變劑量。

126高產(chǎn)多糖突變菌株的篩選

以半致死劑量誘變荷葉離褶傘原生質(zhì)體，挑取優(yōu)先再生、生長(zhǎng)最旺盛的菌落進(jìn)行拮抗試驗(yàn)（3點(diǎn)接種法），初步篩選出40株誘變菌株。在此基礎(chǔ)上，分別將出發(fā)菌株和誘變菌株接入100 mL液體培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，測(cè)定培養(yǎng)液多糖含量（苯酚-硫酸法[12]），進(jìn)一步篩選多糖產(chǎn)量高的菌株。

127遺傳穩(wěn)定性分析

將高產(chǎn)多糖誘變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，均進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，取第1、3、5、6、7、8、9、10代分別測(cè)定菌絲多糖含量。

2結(jié)果與分析

21菌絲生長(zhǎng)曲線

（0472 g/L），8 d以后曲線呈下降趨勢(shì)。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，初步確定菌齡在對(duì)數(shù)期4 d時(shí)進(jìn)行原生質(zhì)體制備。

22不同酶系統(tǒng)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

使用3種單一酶和3種酶組合，30 ℃條件下對(duì)培養(yǎng)4 d的菌絲酶解2 h。從圖2可以看出，選用不同種類(lèi)或組合的脫壁酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較大，在供試的6種酶解液中，使用酶組合進(jìn)行脫壁的效果要顯著優(yōu)于使用單一酶。其中1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)1463×106個(gè)/mL；2%纖維素酶（84×105個(gè)/mL）原生質(zhì)體產(chǎn)量最低。

23酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合，30 ℃條件下對(duì)培養(yǎng)4 d 的菌絲分別酶解1、2、3、4、5 h。從圖3可以看出，酶解時(shí)間在10～25 h范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速提高，在3 h時(shí)達(dá)到最大（131×107個(gè)/mL），隨后產(chǎn)量逐漸下降。故最適酶解時(shí)間為25 h。

24滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別使用06 mol/L硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合酶解，30 ℃條件下對(duì)培養(yǎng)4 d的菌絲酶解25 h制備原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)。從圖4可以看出，同等條件下，06 mol/L的甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為13×107個(gè)/mL，其次是蔗糖和氯化鉀，硫酸鎂作為滲透壓穩(wěn)定劑產(chǎn)量最低，故荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備的最適滲透壓穩(wěn)定劑為 06 mol/L 甘露醇。

25菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別取菌齡2、3、4、5、6、7 d的菌絲體同等條件下制備原生質(zhì)體并計(jì)數(shù)。從圖5可以看出，培養(yǎng)4 d時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)138×107個(gè)/mL，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)4 d后，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸下降，故最佳菌齡為培養(yǎng)4 d，與圖1生長(zhǎng)曲線基本吻合。

26原生質(zhì)體再生

以06 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，25 ℃培養(yǎng)，在第9天出現(xiàn)再生菌落，再生率為127%。

27原生質(zhì)體紫外線誘變

荷葉離褶傘紫外線誘變劑量效應(yīng)曲線見(jiàn)圖6，由此計(jì)算半致死率照射劑量約為20 s。

28高產(chǎn)多糖突變菌株的篩選

根據(jù)拮抗反應(yīng)和菌落生長(zhǎng)狀況，在紫外線照射時(shí)間為 20 s 的平板上篩選出20株菌落形態(tài)無(wú)明顯變化，生長(zhǎng)速度較快的突變菌株。以原始出發(fā)菌株為對(duì)照，測(cè)定其多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表1。篩選出6株誘變菌株，分別為菌株02、10、11、15、21、28。

29遺傳穩(wěn)定性分析

將6株誘變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，測(cè)定菌絲多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。10號(hào)誘變菌株雖然多糖含量最高，但遺傳穩(wěn)定性不好，11號(hào)菌株遺傳穩(wěn)定性好，且多糖含量也高，較出發(fā)菌株提高了3449%。

3結(jié)論與討論

荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備最佳條件為：菌齡4 d，用 06 mol/L 甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合30 ℃酶解25 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)138×107個(gè)/mL，再生率達(dá)127%。原生質(zhì)體紫外線誘變半致死劑量為20 s，根據(jù)拮抗反應(yīng)和菌落生長(zhǎng)狀況，篩選出40株誘變菌株，從中選出6株多糖含量較高的菌株，通過(guò)遺傳穩(wěn)定性分析，獲得1株多糖含量為6 01872 mg/L的誘變菌株，較原始出發(fā)菌株多糖含量提高3449%。

影響原生質(zhì)體釋放的因素有很多[13-15]，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)荷葉離褶傘原生質(zhì)體的制備條件的研究，明確了搖瓶發(fā)酵條件下，菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、酶系統(tǒng)、酶解時(shí)間等條件對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，其中酶系統(tǒng)的選擇對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量影響較大，采用復(fù)合酶的效果要顯著優(yōu)于使用單一酶進(jìn)行酶解。紫外線誘

注：表中00號(hào)為出發(fā)菌株。

變?cè)|(zhì)體育種技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、有效的育種技術(shù)，但經(jīng)紫外線照射后，原生質(zhì)體的再生一般比較困難，給育種工作帶來(lái)一定麻煩。本試驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)大量的誘變工作，篩選到1株高產(chǎn)多糖的菌株。

參考文獻(xiàn)：

上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所中國(guó)食用菌志[M]北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1991

席亞麗，茆愛(ài)麗，王曉琴，等 荷葉離褶傘子實(shí)體、菌絲體及發(fā)酵液蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J] 菌物學(xué)報(bào)，2010，29（4）：603-607

[3]閆肅 荷葉離褶傘子實(shí)體化學(xué)成分與生物活性研究[D] 長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014

[4]魏雨恬，馮娜，張勁松，等 荷葉離褶傘子實(shí)體有機(jī)溶劑萃取物的化學(xué)成分和抗腫瘤活性[J] 食用菌學(xué)報(bào)，2016，23（2）：70-74

[5]Ukawa Y，Ito H，Hisamatsu M Antitumor effects of（1→3）-beta-D-glucan and（1→6）-beta-D-glucan purified from newly cultivated mushroom，Hatakeshimeji（Lyophyllum decastes Sing）[J] Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（1）：98-104

[6]張春梅，宋海，魏生龍荷葉離褶傘菌絲體多糖的提取及還原力的研究[J] 中國(guó)食用菌，2012，31（6）：44-48

[7]王曉琴，曹禮，鄭秀芳，等 荷葉離褶傘多糖的提取工藝及其抑菌作用的研究[J] 中國(guó)食品工業(yè)，2009（12）：51-53

[8]國(guó)外醫(yī)藥編輯部 培養(yǎng)荷葉離褶傘得到的蛋白多糖作腫瘤細(xì)胞免疫增強(qiáng)藥物[J] 國(guó)外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，1992，7（3）：141

[9]朱芬，陳軍，師亮，等 靈芝三萜高產(chǎn)菌株原生質(zhì)體紫外誘變選育[J] 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，31（1）：37-41

[10]許梅 高產(chǎn)多糖大球蓋菇菌株原生質(zhì)體誘變選育及其抗氧化能力研究[D] 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007

[11]張卉，李長(zhǎng)彪，陳明波，等 原生質(zhì)體紫外誘變選育姬松茸新菌株[J] 微生物學(xué)雜志，2004，24（6）：56-57

[12]王曉琴，張芬琴，魏生龍，等 荷葉離褶傘菌絲體深層發(fā)酵及胞內(nèi)外多糖含量的變化[J] 中國(guó)釀造，2011，30（5）：56-58

[13]董汪洋，王鄭隆，楊云喬，等 杏鮑菇的菌株篩選與原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化[J] 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27（5）：782-786

[14]譚文輝，李燕萍，許楊 微生物原生質(zhì)體制備及再生的影響因素[J] 現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：263-265

[15]詹萍，蘇龍，周乃東 紅酵母原生質(zhì)體制備和再生條件研究[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：1154-1155