崔佳雯+++馬書杰++褚立希

[摘要] 目的 探討針刺百會穴結(jié)合游泳訓(xùn)練對大腦中動脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響。 方法 將SD大鼠手術(shù)制成右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型，將手術(shù)模型成功后的28只大鼠進行神經(jīng)功能評定及水迷宮測試后按照隨機數(shù)字表分為模型組、針刺組、游泳組和針游結(jié)合組，每組7只；另設(shè)假手術(shù)組7只。假手術(shù)組及模型組不給予任何治療；針刺組給予百會穴針刺治療，1次/d；游泳組給予游泳訓(xùn)練，1次/d；針游結(jié)合組給予針刺百會穴結(jié)合游泳訓(xùn)練，1次/d。共治療6 d。每天治療前測量體重進行神經(jīng)功能評分，治療6 d后進行水迷宮測試其學(xué)習(xí)記憶能力，測試結(jié)束取腦，采用TUNEL染色觀察海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 治療后針刺和游泳治療無明顯交互作用（P > 0.05），但針游結(jié)合組大鼠神經(jīng)功能評分低于模型組（P < 0.05）；針游結(jié)合組大鼠水迷宮穿越平臺次數(shù)多于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 針刺結(jié)合游泳訓(xùn)練對于大腦中動脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響可能優(yōu)于單純針刺或游泳，需要更深入的研究探索。

[關(guān)鍵詞] 大腦中動脈缺血再灌注；大鼠；針刺；游泳訓(xùn)練；Morris水迷宮；海馬區(qū)；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R743.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（b）-0025-04

The influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats

CUI Jiawen MA Shujie CHU Lixi

College of Rehabilitation Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

[Abstract] Objective To observe the influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats. Methods SD rats were made into the model of right middle cerebral artery ischemia-reperfusion. After evaluation of neurological function test and water maze test operation， the 28 successful model rats were divided into model group， acupuncture group， swimming training group， and integrated acupuncture and swimming training group by random number table， with 7 rats in each group， 7 rats of sham-operation group were set separately. There was no treatment for sham-operation group and model group， the acupuncture group was given acupuncture therapy on GV 20， once per day， while the swimming training group was given swimming training， once per day， and integrated acupuncture and swimming training group was given integrated acupuncture therapy on GV 20 and swimming training， once per day. Total treatment time was 6 days. Each day before treatment， weight and neural functional test were evaluated. After treatment for 6 days， water maze test was detected for the ability of learning and remembering， after all treatment and evaluation， the brains were taken， then TUNEL staining was used to observe the cell apoptosis in hippocampus. Results After treatment， there was no interactive effect between acupuncture and swimming training （P > 0.05）， the neural function score of integrated acupuncture and swimming training group was lower than that of model group （P < 0.05）， the number of step through in water maze test of integrated acupuncture and swimming training group was more than that of model group （P < 0.05）. Conclusion The influence of acupuncture and swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats may be better than acupuncture or swimming training only， more research needs to be done in the future.endprint

[Key words] Middle cerebral artery ischemia-reperfusion； Rats； Acupuncture； Swimming training； Morris water maze； Hippocampus； Cell apoptosis

研究表明，腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率可達72.5%[1]。腦卒中患者的認(rèn)知功能可以提高患者的理解力和執(zhí)行力，從而提高康復(fù)效益[2]。因此腦卒中后的認(rèn)知功能損害越來越受到重視，同時也已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域當(dāng)前研究發(fā)展的重點[3]。Quaney等[4]研究表明有氧運動能提高腦卒中患者的信息處理速度、運動學(xué)習(xí)能力、內(nèi)隱記憶和運動功能。針灸可通過改善血液流變性障礙、調(diào)節(jié)中樞膽堿能遞質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)肽、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)功能、清除自由基、阻止細(xì)胞凋亡、保護神經(jīng)元等途徑改善患者認(rèn)知功能[5-7]。針刺配合康復(fù)訓(xùn)練能夠改善腦卒中后認(rèn)知障礙，降低血漿皮質(zhì)醇含量，且療效優(yōu)于尼莫地平治療[8]。本研究主要探討針刺結(jié)合有氧運動對腦卒中大鼠認(rèn)知功能的影響，為更深入的認(rèn)知改善機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取健康雄性200～220 g SD大鼠，手術(shù)制成右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型，將手術(shù)模型成功后的28只大鼠進行神經(jīng)功能評定及水迷宮測試后，采用數(shù)字隨機法將其分為模型組、針刺組、游泳組和針游結(jié)合組，每組7只；另設(shè)假手術(shù)組7只。

模型組大鼠術(shù)后飼養(yǎng)于普通鼠籠，不予任何治療；游泳組于水迷宮評估后1 d開始每天給予1次游泳訓(xùn)練；針刺組于水迷宮評估后1 d開始每天給予1次百會穴針刺治療；針游結(jié)合組于水迷宮評估后1 d開始每天針刺百會穴結(jié)合游泳訓(xùn)練1次，各組均治療6 d。

1.2 主要試劑及儀器

材料：云龍牌無菌針灸針0.25 mm×25 mm：吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司。試劑：10%水合氯醛：上海國藥集團（批號：20160427）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色（TUNEL）試劑盒：Roche公司（批號：11684817910）。儀器：Morris水迷宮（Morris-water-maze，MWM），包括水池和站臺、CCD攝像頭、視頻采集卡、MWM視頻分析軟件（貨號：DigBehv001動物行為分析系統(tǒng)）：上海吉量軟件科技有限公司產(chǎn)品；正置顯微鏡：OLYMPUS公司（型號：CX41）；IMS圖像分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技（上海）有限公司。

1.3 動物模型制作

大鼠仰臥固定于實驗臺上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 mL/100 g），用改良的Zea Longa's線栓法[9]阻斷大鼠右側(cè)大腦中動脈制作大腦中動脈缺血再灌注局灶性腦缺血模型，2 h后拔去線栓再灌注。模型制作24 h取腦，切片，以TTC染色證明造模方法的有效性[10]。將神經(jīng)功能評分為1、2、3分的大鼠納入實驗研究，0、4分大鼠予以剔除。

1.4 神經(jīng)功能評分

參照Longa等[9]推薦的5分法對再灌注1 d的模型大鼠進行評分：0分：無神經(jīng)損傷；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向栓塞對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向栓塞對側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.5 Morris水迷宮測試

于治療前后對各組大鼠進行水迷宮測試[11]。MWM為直徑160 cm、高50 cm的圓形水池，池壁黑色，水深23 cm，水溫保持在（22±2）C°，在第Ⅳ象限距池壁35 cm處放置直徑為9 cm的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2 cm，試驗前水中加入適量碳素墨汁，使大鼠無法看到水面以下平臺。室內(nèi)溫度高于水溫5 C°以上，光照恒定，無光線直射池內(nèi)，分別予定位航行試驗，記錄大鼠從入水至找到平臺所用時間（逃避潛伏期）；以及去掉平臺后的空間探索試驗，記錄大鼠在原平臺處穿越次數(shù)。

1.6 針刺百會穴

根據(jù)相關(guān)文獻[12-13]選取百會。方法：百會穴向后斜刺2 mm，留針20 min，共治療6 d。

1.7 游泳訓(xùn)練

取一邊長為1 m的正方體容器，水位50 cm，將游泳組及針游結(jié)合組大鼠置于其中游泳20 min，各治療6 d。

1.8 TUNEL染色

取材固定后，將其洗滌、脫水、透明、浸蠟包埋、切片后進行TUNEL染色，具體流程如下：①脫蠟：65℃、30 min；二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min；②水化：將脫蠟后的切片經(jīng)100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、雙蒸水各3 min；③消化：將玻片浸入胰蛋白酶內(nèi)消化40 min，PBS洗3 min×3次；④制備TUNEL反應(yīng)混合液；⑤加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃反應(yīng)1 h；PBS洗3 min×3次；⑥加50 μL POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30 min，PBS洗3 min×3次；⑦DAB染色3～10 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度；⑧脫水：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，逐級脫水，各3 min；⑨透明：二甲苯透明3 min×2次；⑩中性樹膠封片。最后通過200×顯微鏡采集分析樣本，計算凋亡率，被染為深棕色的為凋亡細(xì)胞，正常細(xì)胞很少能夠被染色。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0版統(tǒng)計學(xué)軟件包進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗，多組計量資料采用完全隨機方差分析，各組治療后各計量資料采用2×2析因設(shè)計的方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗結(jié)束后動物存亡數(shù)endprint

實驗結(jié)束后，假手術(shù)組動物7只，死亡0只；模型組動物剩余6只，死亡1只；針刺組動物5只，死亡2只；游泳組動物6只，死亡1只；針游結(jié)合組動物5只，死亡2只。

2.2 治療前假手術(shù)組和模型組各項指標(biāo)比較

治療前假手術(shù)組和模型組神經(jīng)功能評分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），證明造模成功。見表1。

2.3 治療前各手術(shù)組各項指標(biāo)比較

治療前模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組神經(jīng)功能評分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示各手術(shù)組治療前基線一致。見表2。

2.4 治療后各組間各項指標(biāo)比較

治療后，模型組（不使用針刺和游泳）樣本量為6只，針刺組（使用針刺不使用游泳）樣本量為5只，游泳組（不使用針刺使用游泳）樣本量為6只，針游結(jié)合組（使用針刺使用游泳）樣本量為5只。模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組神經(jīng)功能評分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較，無交互影響。見表3～6。

2.5 治療后模型組和針游結(jié)合組各項指標(biāo)比較

模型組與針游結(jié)合組各項指標(biāo)比較，神經(jīng)功能評分及穿越平臺次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示針游結(jié)合組治療后存在一定的陽性趨勢。見表7。

2.6 治療后TUNEL染色所示各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況

治療后假手術(shù)組、模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組海馬區(qū)TUNEL染色后放大200倍的情況，被染為深棕色的為凋亡細(xì)胞，未被染色的為正常細(xì)胞，根據(jù)染色情況而計算出凋亡比率。見圖1（封三）。

3 討論

針刺治療可改善卒中后抑郁大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，提高卒中后抑郁大鼠模型海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）水平[14]；電針對提高腦卒中后大鼠認(rèn)知功能和減少梗阻面積具有顯著療效[15]，其中電針百會、神庭穴等能通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因以及相關(guān)X蛋白有顯著改善認(rèn)知的效果[16]。有氧運動對提高腦卒中患者認(rèn)知能力，尤其對于記憶、注意和視覺空間認(rèn)知有一定的效果[17]；有動物實驗證實，中強度有氧運動對于認(rèn)知測試有實際療效[18]。早期針灸聯(lián)合康復(fù)治療方案可提高老年腦卒中患者的治療效果，促進患者認(rèn)知功能和日常生活能力的提高[19]；針灸結(jié)合康復(fù)治療對腦卒中后的認(rèn)知障礙有交互作用[20]。我們希望通過基礎(chǔ)實驗的研究找到針刺結(jié)合有氧運動改善腦卒中患者認(rèn)知障礙的基本機制，為臨床治療提供可資參考的依據(jù)。

本實驗雖然由于各組均有實驗動物的死亡而致樣本量不足，通過雙因素的方差分析沒有明顯差異，但各項指標(biāo)的均值還是存在著陽性趨勢，說明針游結(jié)合有較單純針刺及單純游泳更佳療效的趨勢。針游結(jié)合組和模型組間治療后神經(jīng)功能評分和穿越平臺次數(shù)有顯著差異，說明針游結(jié)合確實具有一定療效，而其與單純針刺和單純游泳的療效對比仍需待進一步研究探索。

本研究認(rèn)為針游結(jié)合組對于大腦中動脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響可能優(yōu)于單純針刺或單純游泳組，此種方法可以在今后的實驗中擴大樣本量，繼續(xù)深入探索。

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（收稿日期：2017-05-22 本文編輯：張瑜杰）endprint