林鎮(zhèn)海，閆士燦，張潔筠，王 魯，潘 奇

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝臟外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普通外科，上海 200040；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

MST4通過激活MAPK-ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子釋放促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

林鎮(zhèn)海1，閆士燦2，張潔筠3，王 魯1，潘 奇1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝臟外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普通外科，上海 200040；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(mammalian Ste20-like kinase 4，MST4)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，前期研究發(fā)現(xiàn)，MST4可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。該研究旨在探討MST4通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated protein kinaseextracellular signal-regulated kinase，MAPK-ERK)信號(hào)通路影響炎癥因子釋放調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境，促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)方法對(duì)MST4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞中白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和趨化因子2(CC chemokine ligand-2，CCL2)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢查，通過蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)研究MST4對(duì)肝癌細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL2蛋白量的表達(dá)及活性的影響。結(jié)果：MST4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞，其IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和分泌水平顯著高于MST4低表達(dá)的肝癌細(xì)胞系(P＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)MST4可以通過改變ERK磷酸化的水平，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放的改變。結(jié)論：MST4可以通過MAPK-ERK信號(hào)通路活化完成對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)，促進(jìn)炎癥因子的分泌，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4；肝癌；炎癥因子；侵襲和轉(zhuǎn)移

DOI: 10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.09.001

肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球腫瘤發(fā)病率第5位，死亡率居男性腫瘤的第2位［1］。雖然以手術(shù)為中心的肝癌治療取得一定成效，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是肝癌療效的瓶頸。近年，多項(xiàng)研究證實(shí)腫瘤微環(huán)境成分可以預(yù)測(cè)并影響肝癌術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［2］，提示肝癌細(xì)胞與癌周微環(huán)境相互作用的研究可能為解決肝癌治療瓶頸提供突破點(diǎn)。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(mammalian Ste20-like kinase 4，MST4)是常見的哺乳動(dòng)物生發(fā)中心激酶類成員。研究發(fā)現(xiàn)MST4可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移［3-8］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，MST4可提示肝癌的不良預(yù)后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MST4可以激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitional，EMT)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌惡性度增高［9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，MST4還可以調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌［10］。而研究發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中可以通過許多炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、趨化因子2(CC chemokine ligand-2，CCL2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及黏附分子等，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。提示MST4可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境因子的途徑促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究旨在通過檢測(cè)MST4對(duì)肝癌細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL2的影響，探討MST4通過調(diào)節(jié)癌旁微環(huán)境中炎癥因子的表達(dá)促進(jìn)肝癌惡性行為的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞系MHCC97H由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所保存和培養(yǎng)。

1.2 試劑

高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國(guó)Gibco-BRL公司，特級(jí)胎牛血清(40 nm過濾)購自美國(guó)Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化液購自美國(guó)Gibco公司，MST4(rabbit，polyclonal，1∶500)購自美國(guó)Proteintech公司，細(xì)胞總蛋白和核蛋白抽提試劑盒購自美國(guó)Millipore公司，蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)試劑盒購自美國(guó)Millipore公司，大鼠抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)多克隆抗體、大鼠抗人磷酸化ERK(p-ERK)多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG購自上?？党缮锕こ逃邢薰?，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本Toyobo公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL-2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購自英國(guó)Abcam公司，磷酸化ERK抑制劑PD98095等其他各種化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞總蛋白抽提

MHCC97H肝癌細(xì)胞系分為三組［9］，分別為對(duì)照組MHCC97H-WT、高表達(dá)組MHCC97H-MST4和低表達(dá)組MHCC97H-KD，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，每隔3 d傳代1次。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H細(xì)胞分組，進(jìn)行后續(xù)Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)。按照試劑盒說明抽提細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 RTFQ-PCR檢測(cè)

RTFQ-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中的炎癥基因IL-1β、IL-6、CCL2和TNF-α表達(dá)，并且以GAPDH基因?yàn)楣芗一?。?shí)驗(yàn)方法按說明書操作。各引物的序列見表1。

表 1 引物序列圖Tab. 1 Primer sequence

1.3.3 Western blot檢測(cè)ERK和p-ERK的表達(dá)水平

取20 mg總蛋白經(jīng)12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃溫育過夜，次日用洗膜緩沖液洗膜后加入熒光標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫溫育1 h。曝光顯色。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)MST4表達(dá)上調(diào)對(duì)MHCCH97H分泌炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL-2的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)上清液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，37 ℃溫箱溫育貼壁4 h后，設(shè)空白組、MHCC97H-MST4組(MST4轉(zhuǎn)染高表達(dá)組)、MHCC97H-KD組(MST4轉(zhuǎn)染干擾siRNA族)和PD98095組(MST4轉(zhuǎn)染高表達(dá)組+每孔濃度40 μmol/L，5 μL)，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL-2的水平(PD98095為ERK磷酸化抑制劑)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RTFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

RTFQ-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株比低表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株比低表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的分泌量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MST4高表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞株中p-ERK表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。利用p-ERK抑制劑可以有效抑制下游IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄水平和分泌量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.4 使用信號(hào)通路抑制劑對(duì)炎癥因子分泌的ELISA檢測(cè)結(jié)果

ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株比野生的肝癌MHCC97H細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的分泌量增多，利用PD98095抑制ERK的磷酸化，可以明顯抑制MHCC97H細(xì)胞對(duì)炎癥因子的分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖 1 RTFQ-PCR檢測(cè)高表達(dá)MST4和低表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 1 The transcription level of the inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and CCL2 in the high MST4 expression and the low MST4 expression of MHCC97H hepatocellular carcinoma cell lines detected by RTFQ-PCR

圖 2 ELISA檢測(cè)高表達(dá)MST4和低表達(dá)MST4的MHCC97H肝癌細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的分泌量Fig. 2 The secretion of the inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and CCL2 in the high MST4 expression and the low MST4 expression of MHCC97H hepatocellular carcinoma cell lines detected by ELISA

圖 3 Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Result of Western blot detection

圖 4 ELISA檢測(cè)MHCC97H肝癌細(xì)胞株中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的分泌量Fig. 4 The secretion of the inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, TNF-α and CCL2 in the MHCC97H hepatocellular carcinoma cell lines detected by ELISA

3 討 論

MST4屬于常見的哺乳動(dòng)物生發(fā)中心激酶類成員，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化，參與細(xì)胞骨架重排、形態(tài)形成、細(xì)胞凋亡及分化等細(xì)胞活動(dòng)［12］。在乳腺癌和前列腺癌的中，高表達(dá)的MST4與侵襲性和惡性程度密切相關(guān)［13］。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，MST4可以激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌惡性度增高，更重要的是其對(duì)肝癌的不良預(yù)后具有很好地提示作用［9］。本研究在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，首次有針對(duì)性地聚焦于MAPK信號(hào)通路下游的炎癥因子轉(zhuǎn)錄和分泌。通過體外實(shí)驗(yàn)，利用RTFQ-PCR、ELISA和Western blot技術(shù)從不同層面和角度進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)MST4可以通過激活MAPK-pERK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，進(jìn)而使得肝癌細(xì)胞對(duì)IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的分泌增加。為明確其機(jī)制，我們利用MAPK-pERK信號(hào)通路活化的抑制劑對(duì)進(jìn)行MST4高表達(dá)的肝癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)阻斷MAPK-pERK信號(hào)通路后，肝癌細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和CCL2的轉(zhuǎn)錄及分泌水平均下調(diào)。提示MAPK-pERK信號(hào)通路的激活與MST4調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞炎癥因子分泌密切相關(guān)。

ERK是MAPK家族中研究最廣泛的蛋白激酶之一。ERK磷酸化后成為有活性的蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老，還能調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生和分泌［14-15］。炎癥因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，炎癥因子可激活炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，對(duì)于維持慢性炎癥、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)展與增殖、抑制免疫介導(dǎo)的腫瘤監(jiān)視具有非常重要的作用。在眾多因子中，IL-1、IL-6、TNF-α及CCL2的研究較為深入，是公認(rèn)的促癌炎癥因子。在具有肝炎背景的肝惡性腫瘤的研究中，無論是乙肝或是丙肝引起的肝硬化肝癌患者其體內(nèi)細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α及IL-1β的表達(dá)均高于正常人群，由此認(rèn)為這些炎癥因子的分泌失調(diào)促進(jìn)肝癌的早期發(fā)生、發(fā)展［16］。有動(dòng)物模型研究進(jìn)一步證實(shí)，在肝炎轉(zhuǎn)基因小鼠HCC模型中，TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平明顯增高［17-18］。對(duì)臨床肝癌、肝硬化和健康人群中血清IL-6的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者的血液中IL-6水平顯著高于肝硬化和正常人群［19］。Wang等［20］在臨床肝癌病例蛋白芯片的研究中發(fā)現(xiàn)，血清CCL2的變化與肝癌高度相關(guān)，并且認(rèn)為CCL2可作為甲胎蛋白的補(bǔ)償標(biāo)志物從而協(xié)助預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后。上述研究都從現(xiàn)象方面對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及CCL2與肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性進(jìn)行證實(shí)，而機(jī)制研究則進(jìn)一步說明其促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。在腫瘤的發(fā)展中，TNF-α可以通過激活細(xì)胞核因子-κB促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［21］。IL-6、TNF-α和IL-1β在細(xì)胞研究中證實(shí)可以促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，CCL2可以通過誘導(dǎo)并激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［22］。因此，IL-1β、IL-6、TNF-α及CCL2等炎癥因子對(duì)于肝癌的惡性行為具有顯著的促進(jìn)作用。

本研究通過干擾和上調(diào)肝癌細(xì)胞系MHCC97H中MST4表達(dá)的增高從而促進(jìn)了炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及CCL2的轉(zhuǎn)錄和分泌的水平，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MST4可以通過MAPKERK信號(hào)通路活化完成對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌炎癥因子的調(diào)節(jié)。為MST4促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究提供新的理論依據(jù)。

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PAN Qi E-mail: drpanqi@163.com

Background and purpose: It has been reported that mammalian Ste20-like kinase 4 (MST4)promotes the invasion and metastasis of tumors. In the previous research, we found that MST4 promoted invasion and metastasis of liver cancer through epithelial-mesenchymal transition. In this study, we explored the effect of MST4 on promoting the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells by activating MAPK-ERK signaling path way and inflammatory factors. Methods: We used real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RTFQ-PCR) to detect the transcription of IL-1β, IL-6, TNF-α and CCL2 in different HCC cell lines expressing MST4 differently. Then we studied the different secretion of IL-1β, IL-6, TNF-α and CCL2 in cells using Western blot and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results: The RNA transcription and protein translation levels of IL-1β,IL-6, TNF-α and CCL2 were significantly higher in HCC cell line with high expression of MST4 than those in the HCC cell line with lower expression of MST4 (P＜0.05). We found that MST4 could change the level of phosphorylation of ERK to promote secretion of inflammatory cytokines. Conclusion: High expression of MST4 can upregulate the secretion of inflammatory factors (IL-1β, IL-6, TNF-α and CCL2) in HCC cells and enhance the ability of invasion and metastasis of HCC cells, through activating the MAPK-ERK signaling pathway.

Mammalian Ste20-like kinase 4; Hepatocellular carcinoma; Inflammatory factors; Invasion and metastasis

R735.7

：A

：1007-3639(2017)09-0681-06

MST4 upregulates secretion of in fl ammatory factors via activation of MAPK-ERK signaling pathway and promotes invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma LIN Zhenhai1, YAN Shican2,ZHANG Jieyun3, WANG Lu1, PAN Qi1(1. Department of Hepatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032,China; 2. Department of General Surgery, Huashan Hospital of Fudan University, Shanghai 200040, China;3. Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology,Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81602100)；上海市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(12ZR1406200)；復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院院級(jí)基金(2015-2017)。

潘 奇 E-mail：drpanqi@163.com