張祺箐 馮正權(quán)

三葉青黃酮對荷Lewis肺癌小鼠脾臟單個核細胞PGE2、COX-2表達的影響

張祺箐 馮正權(quán)

目的 研究三葉青黃酮對荷Lewis肺癌小鼠脾臟單個核細胞前列腺素E2（PGE2）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達的影響。方法 皮下接種法建立Lewis肺癌小鼠動物模型，接種14天后取脾臟，分離單個核細胞培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）刺激為模型組，塞來昔布（SC58635）為陽性對照，設(shè)三葉青黃酮低、中、高濃度組，無TGF-β1及藥物為空白對照組。ELISA法測定單個核細胞分泌 PGE2、COX-2 濃度。結(jié)果 TGF-β1 刺激 24h 后，與空白對照組 PGE2（99.31±3.82）pg/mL、COX-2（290.49±5.37）pg/mL 比較，其余五組 PGE2、COX-2 均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組脾臟單個核細胞體外分泌PGE2[（138.18±4.00）pg/mL]、COX-2[（331.58±5.78）pg/mL]含量最高。與模型組比較，給藥組PGE2、COX-2含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。PGE2含量依次為塞來昔布組（110.13±2.38）pg/mL＜三葉青黃酮高劑量組（118.18±1.96）pg/mL＜中劑量組（121.62±4.44）pg/mL＜低劑量組（128.90±4.24）pg/mL。COX-2含量依次為塞來昔布組（309.51±2.85）pg/mL＜三葉青黃酮高劑量組（319.64±2.29）pg/mL＜中劑量組（323.92±2.61）pg/mL＜低劑量組（327.07±4.53）pg/mL。給藥組組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 三葉青黃酮在體外可能通過影響PGE2、COX-2表達水平，改善腫瘤微環(huán)境，起到抗腫瘤作用，其作用與劑量呈正比。

荷Lewis肺癌小鼠；三葉青黃酮；單個核細胞；環(huán)氧化酶-2；前列腺素E2

1979年Lord正式提出了“腫瘤微環(huán)境”，指腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細胞本身、間質(zhì)細胞、微血管、微淋巴管、組織液、眾多細胞因子及少量浸潤細胞等共同構(gòu)成[1]。腫瘤微環(huán)境中炎癥因子、腫瘤細胞產(chǎn)生的細胞因子、腫瘤間質(zhì)細胞分泌Toll樣受體、補體等通過不同信號通路眾多途徑發(fā)揮負(fù)向免疫作用。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factors-β，TGF-β）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1） 通過抑制 T細胞免疫反應(yīng)，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn)異常炎性反應(yīng)（PGE2/COX2通路）和腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制（TGF-β誘導(dǎo)Treg）存在一定的關(guān)聯(lián)性[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，PGE2均能在體內(nèi)外刺激Treg生成，而腫瘤衍生的環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）能促進Treg表型的生成。筆者前期研究顯示，三葉青黃酮通過抑制荷瘤小鼠Treg細胞表達，降低外周血中PGE2、COX-2的含量[5]。本次實驗以塞來昔布為陽性對照，通過三葉青黃酮體外干預(yù)，觀察其對肺癌小鼠脾臟單個核細胞分泌PGE2、COX-2的影響，進一步研究其在調(diào)節(jié)腫瘤免疫的效應(yīng)及機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康SPF級雌性C57BL/6小鼠5只，5 周齡，體質(zhì)量（16.80±0.60）g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證：SCXK（滬）2013-0016。Lewis肺癌細胞株由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心對Lewis細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.2 實驗藥品 三葉青購于浙江省中醫(yī)院中藥房，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定，質(zhì)量均符合實驗使用要求。Celecoxib（SC58635）購自 Selleck Chemicals公司。

1.3 主要試劑和儀器 小鼠組織單個核細胞分離液（天津灝洋生物公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（雙抗）、PBS、二甲基亞砜（DMSO）（吉諾生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（浙江省立同德醫(yī)院）；Recombinant Human TGF-β1（PeproTech公司）；重組細胞因子溶解稀釋液套裝（聯(lián)科生物公司）；小鼠PGE2 ELISA試劑盒和小鼠COX-2 ELISA試劑盒（R&D公司）；ELX800全自動酶標(biāo)儀（美國寶特公司）。

2 實驗方法

2.1 荷Lewis肺癌小鼠模型建立 皮下接種法[6]：待Lewis細胞數(shù)目及質(zhì)量滿足接種要求后，將細胞離心分離，然后用PBS液稀釋，混勻制成細胞混懸液（1.0×107/mL）備用。將細胞混懸液接種于已消毒的5只C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮膚，每只0.2mL。觀察接種小鼠成瘤情況。接種后第8天，在小鼠右側(cè)腋窩皮膚下能觸及腫瘤，用游標(biāo)卡尺測量其最短直徑≥8mm，即算造模成功。

2.2 分離脾臟單個核細胞培養(yǎng) 造模成功后，接種后14天，頸椎脫臼處死小鼠，用75%酒精浸泡5min，在無菌條件下摘取脾臟，經(jīng)200目的篩網(wǎng)研碎過濾，1000轉(zhuǎn)/分，離心5min，收集細胞，用密度梯度離心法分離脾臟單個核細胞。細胞計數(shù)后，用RPMI1640（雙抗）+10%胎牛血清稀釋，調(diào)整細胞濃度為1.0×106/mL。

2.3 制備三葉青黃酮 根據(jù)文獻[7]方法提取三葉青黃酮，再依據(jù)馮正權(quán)等[8]研究，使三葉青黃酮粉末溶于二甲基亞砜中，旋渦震蕩，全部溶解過濾除菌，用RPMI1640培養(yǎng)液（雙抗）稀釋，旋渦震蕩混勻后放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。以三葉青粉末最大溶解度為高劑量，設(shè)高、中、低終濃度分別為 12.5、6.25、3.125μg/mL。設(shè)塞來昔布（SC58635）為陽性對照組，終濃度為12.5μg/mL。

2.4 三葉青黃酮對單個核細胞的干預(yù)作用 目前未有類似三葉青黃酮體外干預(yù)在TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌PGE2、COX-2含量的相關(guān)研究。為摸索合適的TGF-β1刺激濃度和觀察時間點，進行了一組預(yù)實驗，分別用 0、5、10、20ng/mL 的 TGF-β1刺激，觀察 24、48、72h，顯示 5ng/mL TGF-β1 刺激24h，單個核細胞分泌的PGE2含量最高。因此設(shè)5ng/mL為TGF-β1刺激濃度。用含10%胎牛血清的1640（雙抗）培養(yǎng)液培養(yǎng)的小鼠脾臟單個核細胞以9.0×105/孔接種于24孔板，模型組加入終濃度為5ng/mL的TGF-β1刺激，三葉青黃酮低、中、高濃度組分別加 入 12.5、6.25、3.125μg/mL 的 三 葉 青 黃 酮 溶 液75μL，陽性對照組加 12.5μg/mL 塞來昔布（SC58635）溶液75μL，不加TGF-β1及藥物者為空白對照組。每劑量組3孔，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察時間為12、24、36h。收集細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測細胞上清液PGE2和COX-2，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進行操作。實驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS Statistics 17.0軟件包處理，計量資料呈正態(tài)分布，用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性時多組間兩兩比較用最小極差法（LSD法），方差不齊時多組間兩兩比較用Dunnett's T3法。以P＜0.05為有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌PGE2含量比較 各組PGE2分泌量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），12h與 36h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各給藥組PGE2含量均高于空白對照組（P＜0.01）。塞來昔布組與三葉青黃酮各劑量組PGE2均低于模型組（P＜0.01）。三葉青黃酮各劑量組PGE2含量高于塞來昔布組（P＜0.01）。三葉青黃酮高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，高劑量組與中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

3.2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌COX-2含量比較 各組COX-2分泌含量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），12h與36h差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各給藥組COX-2含量均高于空白對照組（P＜0.01）。塞來昔布組與三葉青黃酮高、中劑量組的COX-2均低于模型組（P＜0.01）。三葉青黃酮各劑量組COX-2含量均高于塞來昔布組高（P＜0.01）。三葉青黃酮高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，高劑量組與低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

4 討論

TGF-β1是一種多功能的多肽類細胞因子，它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有雙重作用。在正常細胞中，TGF-β1通過阻斷細胞從G1期進入S期而抑制細胞增殖、誘導(dǎo)分化或誘發(fā)凋亡。因此，在腫瘤發(fā)生的早期階段，可阻止腫瘤細胞的增殖。但在腫瘤發(fā)展后期，該信號通路發(fā)生異常改變或功能缺陷，導(dǎo)致細胞不受細胞增殖的調(diào)控。

前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）是細胞膜磷脂代謝產(chǎn)物花生四烯酸（AA）在環(huán)氧化酶COX-1、COX-2和PGE2合成酶的作用下產(chǎn)生的脂質(zhì)小分子，它促進腫瘤生長、血管生成和腫瘤細胞遷移。它還對免疫細胞有明顯的抑制作用，如下調(diào)炎癥趨化因子和Th1型細胞因子的產(chǎn)生，抑制樹突狀細胞的分化，抑制T細胞的增殖，抑制效應(yīng)性T細胞抗腫瘤的作用[9]。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是可誘生型酶，靜息細胞內(nèi)檢測不出，其表達高度受限。但可以被細胞內(nèi)外廣泛的刺激因素所誘導(dǎo)，這些刺激因素包括胃泌素、生長因子、IL-8、表皮生長因子、TNF-α及腫瘤誘導(dǎo)劑或紫外線照射等。COX-2的具體功能目前尚不清楚，在正常生理情況下，它可能參與生殖和分娩等過程；在病理情況下，COX-2可能參與炎癥及腫瘤的形成[10]。

表1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌PGE2含量比較

表1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌PGE2含量比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與塞來昔布組比較，#P＜0.01；與 12h、36h 比較，▲P＜0.05；與三葉青黃酮高劑量組比較，□P＜0.05

組別空白對照組模型組塞來昔布組三葉青黃酮高劑量組三葉青黃酮中劑量組三葉青黃酮低劑量組孔數(shù)333333 12h 94.61±4.63 125.66±4.27*107.91±2.75*△113.13±2.07*△#116.50±4.50*△#□119.21±2.04*△#□24h 99.31±3.82 138.18±4.00*▲110.13±2.38*△▲118.18±1.96*△#▲121.62±4.44*△#▲□128.90±4.24*△#▲□36h 94.41±2.78 126.01±4.04*107.22±2.53*△115.17±1.86*△#118.67±4.67*△#□121.59±6.21*#□

表2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌COX-2含量比較

表2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個核細胞分泌COX-2含量比較

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與塞來昔布組比較，#P＜0.01；與三葉青黃酮高劑量組比較，□P＜0.05；與 12h、36h 比較，▲P＜0.05

組別空白對照組模型組塞來昔布組三葉青黃酮高劑量組三葉青黃酮中劑量組三葉青黃酮低劑量組孔數(shù)333333 12h 283.59±5.34 322.63±6.22*305.46±2.69*△314.67±1.82*△#317.53±2.62*△#319.11±4.46*#□24h 290.49±5.37 331.58±5.78*▲309.51±2.85*△▲319.64±2.29*△#▲323.92±2.61*△#▲327.07±4.53*#□▲36h 285.79±5.53 326.51±5.78*303.60±2.24*△316.07±2.52*△#321.31±2.70*△#323.19±2.95*#□

三葉青，學(xué)名三葉崖爬藤，拉丁名tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國特有的植物[11]。具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功能，在民間三葉青還被用于治療腫瘤，被許多民間驗方收載[12]。丁鋼強等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三葉青可以使小鼠體內(nèi)TNF-α、IFN-γ含量增高，還能增強單核-巨噬細胞吞噬功能。TNF-α具有明確的體內(nèi)外殺傷腫瘤細胞的作用[13-14]，TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷作用是通過其誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)的。馬丹丹等[15]研究顯示，三葉青多糖有明顯的抗肝損傷效果。利用有機溶劑萃取的方式提取三葉青后，黃酮類是應(yīng)用價值最高的有效成分，其次還有多糖類物質(zhì)、甾類化合物、有機酸、酯類化合物等。郝皖蓉[16]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/mL）的三葉青黃酮通過體內(nèi)實驗?zāi)芟抡{(diào)荷肺癌鼠外周血及脾臟單個核細胞中的Treg細胞比例。

為進一步研究三葉青黃酮對脾臟單個核細胞的體外作用，預(yù)實驗結(jié)果表明，正常小鼠脾臟單個核細胞也會分泌PGE2，且24、48、72h 3個時間點無明顯差異，含量較平穩(wěn)。TGF-β1作為腫瘤微環(huán)境中的細胞因子，在一定濃度下（5ng/mL）能刺激脾臟單個核細胞分泌PGE2增多，但以24h PGE2含量最高。本研究結(jié)果顯示，荷Lewis肺癌小鼠因腫瘤發(fā)生微環(huán)境變化，使TGF-β1增多，推測其濃度增大到達一定程度時激發(fā)炎癥通路，使PGE2、COX-2含量明顯較空白對照組增高（P＜0.01）。

各藥物干預(yù)組PGE2、COX-2與模型組相比均有下降（P＜0.01），三葉青黃酮各組中以三葉青黃酮高劑量組PGE2、COX-2下降最顯著，說明作用與其濃度呈正相關(guān)。推測三葉青作為清熱解毒的代表中藥，能減少腫瘤相關(guān)炎癥因子的含量，逆轉(zhuǎn)PGE2/COX-2通路，改善腫瘤微環(huán)境，為逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制提供了實驗依據(jù)。

［1］Ezio Laconi.The evolving concept of tumor microenvironments［J］.Bioessays，2007，29（8）：738-744.

［2］Neil JR，Johnson KM，Nemenoff RA，et al.Cox-2 inactivates Smad signaling and enhances EMT stimulated by TGF-beta through a PGE2-dependent mechanisms［J］.Carcinogenesis，2008，29（11）：2227-2235.

［3］Baratelli F，Lin Y，Zhu L，et al.Prostaglandin E2 induces FOXP3 gene expression and T regulatory cell function in human CD4+T cells［J］.Immunol，2005，175（3）：1483-1490.

［4］Sharma S，Yang SC，Zhu L，et al.Tumor cyclooxygenase-2/prostaglandin E2 -dependent promotion of FOXP3 expression and CD4+CD25+T regulatory cell activities in lung cancer［J］.Cancer Res，2005，65（12）：5211-5220.

［5］馮正權(quán)，林曉陽，郝皖蓉.三葉青黃酮對荷lewis肺癌鼠免疫抑制相關(guān)細胞因子的干預(yù)作用［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19（3）：275-279.

［6］張國明，龐作良，羅洞波.小鼠肺癌模型的建立及其在順鉑、恩度對比試驗中的應(yīng)用［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，32（7）：946-948+951.

［7］傅婷婷.三葉青總黃酮的提取和純化工藝研究［D］.浙江大學(xué)，2010.

［8］馮正權(quán)，倪克鋒，何煜，等.三葉青黃酮誘導(dǎo)SGC－7901胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11（6）：669-672

［9］Harris SG，Padilla J，Koumas L，et al.Prostaglandins as modulators of immunity ［J］.Trendsin Immunology，2002，23（3）：144.

［10］李春生，李泉林，夏海波，等.環(huán)氧化酶-2與腫瘤關(guān)系研究進展［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，27（1）：121-123.

［11］黃真，胡瑛瑛.正交試驗法優(yōu)選三葉青中總黃酮的提取工藝［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（1）：34-36.

［12］丁鋼強，徐彩菊，孟佳，等.三葉青對小鼠細胞因子及免疫功能影響研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（9）：1724-1726.

［13］盧琳，王戰(zhàn)聚，崔為發(fā).IFN-γ與腫瘤免疫逃避的研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊，2004，24（5）：419-322.

［14］夏紹軍.中醫(yī)藥與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)概述［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2004，16（4）：388-390.

［15］馬丹丹，李偉平，馬哲龍，等.三葉青多糖抗肝損傷作用的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（1）：33-36.

［16］郝皖蓉.中藥三葉青總黃酮對荷lewis肺癌小鼠調(diào)節(jié)性T細胞的影響［D］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

Effect of Flavonoid Extract from Radix Tetrastigme on PGE2 and COX-2 in Spleen Mononuclear Cells of Lewis Lung Carcinoma Mice

ZHANG Qiqing,FENG Zhengquan.

Department of Oncology,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect of flavonoid extract of Radix Tetrastigme on the Expression of prostaglandin 2（PGE2） and cyclooxygenase-2（COX-2） in spleen mononuclear cells of mice with lung cancer.MethodsLewis lung carcinoma model was established with subcutaneous inoculation and the spleen was obtained after 14 days to isolate mononuclear cells,than were divided into model group（with TGF-β1 stimulation）,positive group（with celebrex）,low-,medium-,and high-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups,and blank group.ELISA was used to determine the contents of PGE2 and COX-2.ResultsAfter 24-h TGF-β1 stimulation,compared to blank group（PGE2:99.31±3.82pg/mL,COX-2:290.49±5.37pg/mL）,the contents of PGE2 and COX-2 in other 5 groups increased with a significant difference（P＜0.01）.The highest level of PGE2 and COX-2 was in model group（138.18±4.00pg/mL and 331.58±5.78pg/mL,respectively）.Compared with model group,the contents of PGE2 and COX-2 in drug groups were significantly reduced（P＜0.01）.The PGE2 level in celebrex group and high-,medium-,and low-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups were as follows:110.13±2.38pg/mL,118.18±1.96pg/mL,121.62±4.44pg/mL,and 128.90±4.24pg/mL;the COX-2 level were the following:309.51±2.85pg/mL,319.64±2.29pg/mL,323.92±2.61pg/mL and 327.07±4.53pg/mL;siginifcant difference was found among drug groups（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionFlavonoid extract of Radix Tetrastigme can improve the tumor microenvironment by regulating the expression of PGE2 and COX-2 to against the tumor in a dose-dependent manner.

Lewis lung cancer mice;flavonoid extract of Radix Tetrastigme;mononuclear cell;cyclooxygenase-2;prostaglandin 2

項目來源：浙江省自然科學(xué)計劃項目（No.Y12H270055）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技計劃項目（No.JDZX2015251）

浙江省立同德醫(yī)院腫瘤科（杭州 310012）

馮正權(quán)，E-mail：fzhq213@163.com

（收稿：2017-04-26 修回：2017-06-20）