鄭智　曹曉恩　陳海迎　張紅萍

[摘要] 目的 分析高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果為未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（atypical squamous cells of undertermined significance，ASC-US）的患者的分流價(jià)值。方法 選取311例疑似宮頸病變患者同時(shí)行高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)、HPV-DNA分型檢測(cè)和宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test，TCT）和細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-US患者均行陰道鏡檢查和宮頸活檢。以病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASC-US的患者的檢測(cè)效率。 結(jié)果 共85例ASC-US患者，其中慢性宮頸炎患者42例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ級(jí)患者23例，CIN Ⅱ級(jí)患者7例，CIN Ⅲ 級(jí)患者13例。診斷TCT結(jié)果為ASC-US患者高級(jí)別宮頸病變的特異度比較，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)（80.0%）明顯高于HPV-DNA分型檢測(cè)（58.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.458，P<0.001）；兩組敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 結(jié)論 與HPV-DNA分型檢測(cè)相比，高危HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果為ASC-US患者具有更明確的分流意義，在TCT結(jié)果為ASC-US患者的分流管理等方面均有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 人乳頭瘤病毒；E6/E7 mRNA；未明確意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變

[中圖分類(lèi)號(hào)] R711 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）26-0027-04

The bypass value of high-risk HPV E6/E7 mRNA detection in the patients with ASC-US

ZHENG Zhi1 CAO Xiao'en2 CHEN Haiying1 ZHANG Hongping1

1.Department of Gynecology and Obstetrics，Wenzhou People's Hospital of Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China；2.Department of General Surgery，Ouhai District Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine of Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the bypass value of high-risk human papillomavirus（HPV） E6/E7 mRNA detection in the patients whose cervical cytology results are atypical squamous cells of undertermined significance（ASC-US）. Methods A total of 311 patients with suspected cervical lesions were given high-risk HPV E6/E7 mRNA detection， HPV-DNA typing and thinprep cytologic test（TCT） of cervical exfoliative cells. The patients with cytology results of ASC-US were all given colposcopy and cervical biopsy. The pathological report was taken as the gold standard. The efficacy of the two detection methods for the patients with cytology results of ASC-US was compared. Results There were a total of 85 ASC-US patients. There were 42 patients with chronic cervicitis， 23 patients with cervical intraepithelial neoplasia（CIN） grade Ⅰ， 7 patients with CIN grade Ⅱ and 13 patients with CIN grade Ⅲ. Diagnostic TCT results were the comparison of specificity of ASC-US patients with high-grade cervical lesions. The high-risk HPV E6/E7 mRNA detection（80.0%）was significantly higher than the typing test of HPV-DNA（58.2%）， and the difference was statistically significant（χ2=13.458， P<0.001）； there was no statistically significant difference between the two groups in sensitivity， positive predictive value and negative predictive value（P>0.05）. Conclusion Compared with HPV-DNA typing test， the result of high-risk HPV E6/E7 mRNA detection for cervical cytology is a clearer bypass significance for ASC-US patients. In the bypass management for the patients with the TCT results of ASC-US， there is an important clinical application value.endprint

[Key words] Human papillomavirus（HPV）；E6/E7 mRNA；Atypical squamous cells of undertermined significance（ASC-US）；Cervical intraepithelial neoplasia

宮頸癌是困擾全世界女性的第二大惡性腫瘤，我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)國(guó)家，患病率和死亡率均居世界首位，大約占全世界的1/3[1]。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染已被認(rèn)定是導(dǎo)致宮頸癌的必要因素[2]。宮頸液基細(xì)胞學(xué)報(bào)告中，ASC-US為意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞，其細(xì)胞異常程度較反應(yīng)性改變細(xì)胞明顯，但在數(shù)量和質(zhì)量上尚不能確診為鱗狀上皮內(nèi)病變，是最為常見(jiàn)的細(xì)胞學(xué)異常，同時(shí)存在宮頸癌前病變，甚至宮頸癌的可能[3]。如何對(duì)ASC-US進(jìn)行分流一直存在爭(zhēng)議。近年來(lái)，臨床常用HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果做為是否需要陰道鏡檢查的重要分流依據(jù)。然而有研究顯示HPV-DNA檢測(cè)雖然具有較高的敏感性，但其特異性并不理想[4]。為探討高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果為ASC-US患者分流的診斷價(jià)值，本研究選擇85例TCT為ASC-US患者行陰道鏡宮頸活檢病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年8月～2015年3月在我院婦科門(mén)診及住院的可疑宮頸病變患者共311例做為研究對(duì)象，患者年齡19～77歲，中位年齡39.6歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)為白帶增多，性生活后出血，白帶夾雜血絲，體檢發(fā)現(xiàn)宮頸肥大、宮頸糜爛、宮頸贅生物等。311例患者均知情并自愿行高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)、HPV-DNA分型檢測(cè)和宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）。其中根據(jù)宮頸細(xì)胞學(xué)Bethesda分類(lèi)系統(tǒng)（the Behtesda system）診斷為ASC-US患者共85例，均行陰道鏡檢查及宮頸活組織檢查，并取得組織病理學(xué)檢查結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌史、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）史、宮頸錐切術(shù)史及盆腔放射治療史、急性生殖道炎癥者、妊娠者，取材 3 d 內(nèi)有陰道沖洗及用藥史及檢查前 24 h 內(nèi)有性生活史。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 TCT檢測(cè) 由專(zhuān)業(yè)婦科醫(yī)師取材?；颊呷“螂捉厥?，采用專(zhuān)業(yè)取樣刷插入宮頸口，沿著頸管朝同一時(shí)鐘方向旋轉(zhuǎn)3～5周收集宮頸口及宮頸管細(xì)胞，并將細(xì)胞涮洗入盛有PreservCyt保存液的小瓶?jī)?nèi)。標(biāo)本用Thinprep 2000系統(tǒng)程序化處理并自動(dòng)制成薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后由固定病理科醫(yī)師閱片。細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果按照2001年TBS分類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)，≥ASC-US為陽(yáng)性。

1.2.2 HPV-DNA分型檢測(cè) 試劑盒購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司，采用DNA導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)一次性檢測(cè)21種HPV亞型，13種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型）檢測(cè)出一種或多種為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 試劑盒購(gòu)自河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司。采用TCT檢測(cè)的剩余標(biāo)本，采用bDNA檢測(cè)技術(shù)，放大、雜交捕獲mRNA，同時(shí)對(duì)14種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型）E6/E7 mRNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)?？截悢?shù)>0 copy/mL為結(jié)果陽(yáng)性。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸組織病理學(xué)檢查 采用德國(guó)萊卡公司生產(chǎn)的陰道鏡，由宮頸疾病診療中心的專(zhuān)業(yè)婦科醫(yī)師進(jìn)行操作和檢查。患者于月經(jīng)干凈3～7 d 進(jìn)行陰道鏡檢查。標(biāo)本用10%甲醛固定，制片后由專(zhuān)業(yè)病理科醫(yī)師閱片。病理診斷分為正常/炎癥、CIN Ⅰ級(jí)、CIN Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)或?qū)m頸原位癌、宮頸浸潤(rùn)癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩者計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩種檢測(cè)方法診斷ASC-US患者高級(jí)宮頸病變的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值采用傳統(tǒng)列聯(lián)表計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理檢查結(jié)果

本研究結(jié)果中細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASC-US的患者共計(jì)85例，包括慢性宮頸炎患者42例（49.4%），CIN Ⅰ級(jí)患者23例（27.1%），CIN Ⅱ級(jí)患者7例（8.2%），CIN Ⅲ級(jí)患者13例（15.3%）。根據(jù)組織病理學(xué)結(jié)果不同分為兩組：慢性宮頸炎、CIN I組65例，高級(jí)別宮頸病變組20例。見(jiàn)表1。

2.2 高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與HPV-DNA分型檢測(cè)對(duì)ASC-US患者的分流比較

高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷ASC-US患者高級(jí)別宮頸病變的特異度明顯高于HPV-DNA分型檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.458，P<0.001）；兩者敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

液基細(xì)胞學(xué)中，ASC-US是一個(gè)不定級(jí)別，其診斷的靈活性大，診斷標(biāo)準(zhǔn)不確定，局部炎癥、老年性退行性變、CIN及宮頸浸潤(rùn)癌等宮頸細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果均可呈ASC-US，因此常被作為細(xì)胞學(xué)診斷的“垃圾桶”[5]。在臨床工作中，TCT結(jié)果為ASC-US的患者很常見(jiàn)，相比正常細(xì)胞的婦女，這些患者向高級(jí)別宮頸病變發(fā)展的幾率更大。目前如何分流ASC-US患者，國(guó)際上意見(jiàn)仍不統(tǒng)一，可以重復(fù)細(xì)胞學(xué)檢查、HPV檢測(cè)或直接進(jìn)行陰道鏡檢查[6-7]，合理有效地分別對(duì)待TCT結(jié)果為ASC-US的患者是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。

在臨床工作中，HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果常做為宮頸細(xì)胞學(xué)為ASC-US的患者是否需要進(jìn)一步陰道鏡檢查的重要分流指標(biāo)。HPV-DNA檢測(cè)已在全世界臨床上廣泛應(yīng)用，目前檢測(cè)技術(shù)已較為成熟，具有靈敏度高、檢測(cè)方便、費(fèi)用較低等優(yōu)勢(shì)。但是HPV感染比較普遍且多數(shù)患者能自行消退，所有的HPV-DNA檢測(cè)均是病因?qū)W檢測(cè)，只能提示有無(wú)感染HPV，卻無(wú)法區(qū)分是短暫的無(wú)意義感染還是持續(xù)感染，也無(wú)法證實(shí)病毒有無(wú)整合到宿主細(xì)胞中，更無(wú)法判讀出病毒癌基因是否有活性的表達(dá)及表達(dá)量多少。美國(guó)國(guó)立腫瘤研究院進(jìn)行多中心研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞學(xué)為ASC-US的患者中，HPV-DNA檢測(cè)CIN及以上的敏感度為96.3%，其中真正需要陰道鏡檢查和宮頸活檢的患者僅有56.1%[8]。因此，利用特異度不高HPV-DNA分型檢測(cè)對(duì)細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-US的患者進(jìn)行分流可能導(dǎo)致一部分患者進(jìn)行不必要的陰道鏡檢查及宮頸活組織檢查，不僅造成過(guò)度診斷、過(guò)度治療，而且導(dǎo)致醫(yī)療成本過(guò)高并增加了這部分人群的心理壓力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有多項(xiàng)研究表明與HPV-DNA檢測(cè)相比，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查、異常細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的特異度較高，而靈敏度相似[9-11]。endprint

HPV感染宮頸細(xì)胞后病毒DNA有兩種存在狀態(tài)：整合狀態(tài)及游離狀態(tài)。宮頸病變的程度取決于病毒存在的狀態(tài)，在宮頸良性病變中HPV DNA一般多以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞染色體外；在惡性腫瘤中，高危型HPV-DNA多與宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體整合[12]。HPV感染的宮頸癌進(jìn)展與病毒的整合緊密相關(guān)，有研究報(bào)道100%的HPV 18陽(yáng)性、80%的HPV 16陽(yáng)性和81%的HPV 31陽(yáng)性的宮頸癌中顯示有病毒DNA整合[13]。高危型HPV病毒感染宿主細(xì)胞后，病毒核酸游離到細(xì)胞核內(nèi)并整合到宿主細(xì)胞的基因組中[14]，HPV E6、E7癌基因轉(zhuǎn)錄形成E6/E7 mRNA，進(jìn)一步翻譯形成E6、E7蛋白可分別結(jié)合宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)的抑癌蛋白p53和pRb并使之失活，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[15]。因此通過(guò)檢測(cè)高危型HPV E6/E7 mRNA水平可以推斷出高危型HPV對(duì)宿主細(xì)胞的感染水平以及致癌能力[16-17]。Molden T等[18]通過(guò)對(duì)細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-US及LSIL的宮頸病變患者進(jìn)行2年的隨訪研究，發(fā)現(xiàn)與HPV-DNA檢測(cè)相比，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸病變的敏感性相當(dāng)，但其特異性更高，能對(duì)該部分患者進(jìn)行更好的分流[18]。本研究對(duì)85例宮頸液基細(xì)胞學(xué)為AS-CUS患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明檢測(cè)ASC-US患者高級(jí)別宮頸病變效能比較，高危型HPV E6/E7 mRNA的特異度為80.0%，明顯高于HPV-DNA分型檢測(cè)的58.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.458，P<0.001）。高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)具有更高的特異度，說(shuō)明其能夠更好地識(shí)別并剔除正常或低度病變?nèi)巳?，能夠減少過(guò)度診斷和陰道鏡轉(zhuǎn)診率，避免不必要的有創(chuàng)檢查，減少患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，更重要的是可以減緩患者身心負(fù)擔(dān)。另一方面，本研究結(jié)果顯示高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的靈敏度與HPV-DNA分型檢測(cè)比較無(wú)差異，也使其漏診的風(fēng)險(xiǎn)并不比HPV-DNA分型檢測(cè)增加，對(duì)ASC-US患者的高級(jí)別病變同樣具有較高的辨別能力。同時(shí)，與HPV-DNA檢測(cè)相似的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值也保證高危型HPV mRNA檢測(cè)同樣具有準(zhǔn)確判定ASC-US患者有無(wú)病變進(jìn)展高危風(fēng)險(xiǎn)的能力，其診斷可信度較高。

雖然高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)具有與HPV-DNA檢測(cè)相當(dāng)?shù)撵`敏度，該檢測(cè)在臨床實(shí)際工作中尚存在一定的漏診率，導(dǎo)致部分患者不能如實(shí)地被診斷，從而延誤病情，所以為了減少患者的漏診率，在實(shí)際工作中可以考慮采用聯(lián)合的檢測(cè)的方法進(jìn)行篩查，如可以用高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)來(lái)診斷疾病，不僅提高了宮頸疾病的診斷水平，而且還可以降低漏診率[19-20]。

本研究結(jié)果表明，與HPV-DNA分型檢測(cè)比較，高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)ASC-US患者高級(jí)別宮頸病變更具特異性，可以避免過(guò)多的陰道鏡檢查，有望成為ASC-US患者是否需要陰道鏡檢查的一個(gè)有效分流指標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 郎景和. 迎接子宮頸癌預(yù)防的全球挑戰(zhàn)與機(jī)遇[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2002，37（3）：129-131.

[2] Tommasino M. The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis[J]. Semin Cancer Biol，2014，26：13-21.

[3] Eversole GM，Moriarty AT，Schwaaz MR，et al. Practices of participants in the college of American pathologists inerlaboratory eomparison program in cervicovaginal cytology[J]. Arch Pathol Lab Med，2010，134（3）：331-335.

[4] Cuzick J，Arbyn M，Sankaranarayanan R，et a1. Overview of human papillomavirus-based and other novel options for cervical cancer screening in developed and developing countries[J]. Vaccine，2008，26：K29-K41.

[5] Fanny L，Orlando Q，Trinidad B，et al. Follow-up of women with ASCUS in Chile[J]. Diagn Cytopathol，2011，39（4）：258-263.

[6] Boardman LA，Kennedy CM. Management of atypical squamous cells，low-grade squamous intraepithelial lesions，and cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ[J]. Obstet Gyn Clin North Am，2008，35（4）：599-614.

[7] Wright TC Jr，Massad LS，Dunton CJ，et al. 2006 consensus guidelines for the management of women with abnormal cervical screening tests[J]. J Low Genit Tract Dis，2007， 11（4）：346-355.

[8] Koutsky LA. Human papillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence of low-grade squamous intraepithelial lesions：Baseline data from a randomized trial[J]. J Natl Cancer Inst，2000，92（5）：397-402.endprint

[9] 姜俊，陳宜剛，王華，等. 人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA的檢測(cè)在宮頸癌篩查中的初步評(píng)價(jià)[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，33（9）：1261-1264.

[10] 張生枝，邵華江，馬建婷. 人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，（18）：582-585.

[11] 劉佳佳，馮姝，瞿全新，等. 高危型人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA在宮頸病變篩查中的作用研究[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2014，17（10）：1140-1143.

[12] Kalantari M，Blennow E，Hagmar B，et al. Physical state of HPV16 and chromosomal mapping of the integrated form in cervical carcinomas[J]. Diagn Mol Pathol，2001， 10（1）：46-54.

[13] Cullen AP，Reid R，Campion M，et al. Analysis of the physical state of different human papillomavirus DNAs in intraepithelial and invasive cervical neoplasm[J]. J Virol，1991，65（2）：606-612.

[14] Daniel B，Rangarajan A，Mukherjee G，et al. The link between integration and expression of human papillomavirus type 16 genomes and cellular changes in the evolution of cervical intraepithelial neoplastic lesions[J]. J Gen Virol，1997，78：1095-1101.

[15] Martin AG. Molecular biology of cervical cancer[J]. Clinical&Translational Oncology，2007，9（6）：347-354.

[16] 李新敏，潘曉琳. p53與HPV相關(guān)性宮頸癌[J]. 腫瘤防治研究，2007，34（10）：798-800.

[17] Nurkkala M，Wassén L，Nordstr？觟m I，et al. Conjugation of HPV16 E7 to cholera toxin enhances the HPV-specific T-cell recall responses to pulsed dendritic cells in vitro in women with cervical dysplasia[J]. Vaccine，2010，28（36）：5828-5836.

[18] Molden T，Nygard JF，Kraus I，et al. Predicting CIN2+ when detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR：A 2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL pap smear[J]. Int J Cancer，2005，114（6）：973-976.

[19] 劉桐宇，謝榕，鄭雄偉，等. TCT標(biāo)本檢測(cè)高危HPV E6/E7 mRNA及在宮頸病變中的應(yīng)用研究[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2011，7（3）：202-205.

[20] 李曉林，劉瑩，范俊，等. hrHPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)用于宮頸癌聯(lián)合篩查的橫斷面研究[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2016，25（10）：739-743.

（收稿日期：2017-07-01）endprint