黃思念，程美紅 ，譚云山，姚俊霞，靖紅艷

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院病理科，上海 201700；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032）

乳腺癌中Nestin與CD133的表達與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

黃思念1，程美紅1，譚云山2，姚俊霞1，靖紅艷1

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院病理科，上海 201700；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032）

目的 探討乳腺癌中巢蛋白(Nestin)與CD133的表達與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的關(guān)系。方法 收集復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院2010年1月至2013年6月67例乳腺癌病理標本，使用免疫組織化學染色，觀察Nestin、CD133與E-cadherin在乳腺癌中的表達。結(jié)果 Nestin的總體陽性率為73.13%(49/67)，CD133的總體陽性率為40.30%(27/67)。Nestin在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率分別為90.48%(19/21)和65.22%(30/46)，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而CD133的分別為71.43%(15/21)和26.09%(12/46)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Nestin和CD133在E-cadherin陰性組中的陽性率為95.83%(23/24)和58.33%(14/24)，高于在E-cadherin陽性組中的60.47%(26/43)和30.23%(13/43)，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)論 Nestin能夠用以特異性檢測乳腺癌干細胞的表達，CD133能夠用以特異性檢測三陰性乳腺癌中干細胞的表達，乳腺癌組織表達干細胞標記可能與腫瘤細胞發(fā)生EMT有關(guān)。

乳腺癌；三陰性乳腺癌；巢蛋白；CD133；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

近年來乳腺癌干細胞與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)關(guān)系的研究給乳腺癌的治療提供了新的方向。EMT是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型的一種去分化現(xiàn)象，是有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)換為有移行能力的間質(zhì)細胞，同時獲得侵襲性和遷移能力[1]。有研究者發(fā)現(xiàn)，通過外界刺激，乳腺癌細胞發(fā)生EMT，開始表達間質(zhì)表型，同時獲得自我更新能力和干細胞表型[2]。傳統(tǒng)的乳腺癌干細胞研究一般選用CD44+/CD24-/low作為干細胞標記，而進一步的研究顯示CD44+/CD24-/low的乳腺癌細胞群存在異質(zhì)性，其篩選出來的干細胞還可以細分為不同的亞群，有些細胞亞群并沒有形成腫瘤的能力，提示用該分子標記篩選出的細胞不完全是乳腺癌干細胞[3]。因此有必要篩選其他的干細胞標記或聯(lián)合運用多種干細胞標記用于乳腺癌干細胞的研究。巢蛋白(Nestin)作為一種干細胞標記，多表達于一些神經(jīng)源性腫瘤中，其表達提示腫瘤的惡性程度和侵襲性更大[4]。而CD133是一種位于細胞表面的跨膜糖蛋白，其表達水平隨著細胞的成熟分化迅速下調(diào)，可以分離和鑒定干細胞和祖細胞[5]。兩者能否作為一個新的乳腺癌干細胞標記，成為干細胞治療的靶點，尚需進一步的研究。

三陰性乳腺癌是一類對雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(Her-2)三種蛋白均不表達的乳腺癌亞型。三陰性乳腺癌不能從內(nèi)分泌和靶向治療中獲益，預后較差，是臨床治療的難題。三陰性乳腺癌對治療的抵抗性是否與其存在較高的乳腺癌干細胞比例有關(guān)，尚未得到深入研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院2010年1月至2013年6月的67例乳腺癌手術(shù)根治標本，腫瘤直徑0.8～3.5 cm，術(shù)后病理檢查均為浸潤性導管癌，Ⅱ～Ⅲ級，所有標本均已檢測ER、PR、Her-2、上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)。

1.2 實驗方法 手術(shù)切除標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察。所有標本均采用免疫組化Envision二步法，使用Leica全自動免疫組織化學儀操作，切片常規(guī)脫蠟，水化，常溫阻斷，抗原枸櫞酸鹽熱修復，一抗室溫孵育60 min，二抗室溫孵育15 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染、常規(guī)脫水，透明中性樹膠封片。一抗包括ER(工作濃度1:50)、PR(工作濃度1:50)、E-cadherin(工作濃度 1:150)，購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；Her-2(工作濃度1:100)、Nestin(工作濃度1:100)、CD133(工作濃度1:100)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DS9800(LEICA)為二抗，購自上海譽源醫(yī)療設備有限公司。用已知陽性切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照Envision二步法。

1.3 陽性判讀標準

1.3.1 Nestin和CD133陽性結(jié)果 Nestin陽性表達為胞漿出現(xiàn)棕黃色，使用陽性細胞占腫瘤細胞百分比的方法分析結(jié)果，標準如下：Nestin陽性細胞百分比＜1%判讀為陰性；Nestin陽性細胞百分比≥1%判讀為陽性[6]。CD133陽性表達為胞膜出現(xiàn)棕黃色，使用陽性細胞數(shù)分析結(jié)果，選取4個陽性范圍最大的高倍視野(×400倍)，計數(shù)約200個細胞，CD133陽性細胞數(shù)＞10%判讀為陽性，≤10%判讀為陰性[7]。

1.3.2 ER、PR判讀標準[8]腫瘤細胞胞核有棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞數(shù)少于10%為陰性，陽性細胞數(shù)大于10%判定為ER、PR陽性。

1.3.3 Her-2判讀結(jié)果 按照ASCO臨床實踐指南推薦的評分系統(tǒng)[9]：腫瘤細胞環(huán)繞胞膜有棕黃色顆粒為陽性，未觀察到著色或≤10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整著色為陰性；＞10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)不完整的著色或≤10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)完整著色判讀為++；＞10%的腫瘤細胞呈現(xiàn)完整著色判讀為+++。我們在實驗中將染色結(jié)果3++才判定為陽性。

1.3.4 E-cadherin判讀標準[10]腫瘤細胞胞核有棕黃色顆粒為陽性，≤50%判讀為陰性，＞50%判讀為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS統(tǒng)計軟件(Version 19.0，Chicago，IL，USA)進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 乳腺癌細胞完整環(huán)繞胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為Her-2陽性，Envision二步法（×100）；圖2 乳腺癌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為Nestin陽性，Envision二步法（×200）；圖3 乳腺癌細胞胞膜出現(xiàn)突出于背景的棕黃色顆粒為CD133陽性，Envision二步法（×200）

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 67例乳腺癌患者年齡36～92歲，平均64歲。三陰性乳腺癌21例，非三陰性乳腺癌46例。其中Her-2陽性患者12例，Her-2陽性表達為環(huán)周膜染色(圖1)。

2.2 Nestin和CD133在乳腺癌中的表達 免疫組織化學染色顯示Nestin陽性表達為細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖2)。Nestin在乳腺癌、三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率分別為73.13%(49/67)、90.48%(19/21)、65.22%(30/46)，Nestin在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。免疫組織化學染色顯示CD133陽性表達為細胞膜出現(xiàn)突出于背景的棕黃色(圖3)。CD133在乳腺癌、三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中的陽性率 分 別 為 40.30%(27/67)、71.43%(15/21)、26.09%(12/46)，CD133在三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌中陽性率比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.3 乳腺癌中Nestin和CD133的表達與E-cadherin的關(guān)系 Nestin在E-cadherin陽性組和E-cadherin陰性組中的陽性率分別為60.47%(26/43)和95.83%(23/24)，兩組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。CD133在 E-cadherin陽性組和 E-cadherin陰性組中的陽性率分別為30.23%(13/43)和58.33%(14/24)，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

近年來的研究表明，EMT和獲得干細胞表型之間似乎存在某種關(guān)聯(lián)，并形成了一個假設，即發(fā)生了EMT的腫瘤細胞通過獲得了類似于干細胞的自我更新的能力，同時表達干細胞標記[2]。人體乳腺組織中顯示存在表達干細胞標記Nestin的細胞，有研究在人體乳腺組織中分離出Nestin陽性的干細胞[11]。我們在實驗中，同樣觀察到Nestin陽性的腫瘤細胞，其73.13%的陽性率遠遠高于傳統(tǒng)的乳腺癌干細胞標記CD44+/CD24-/low 58.7%[12]的陽性率。Nestin在乳腺癌中的表達率較高，或許可以作為一個較敏感的乳腺癌干細胞標記。

Wright等[13]從乳腺癌細胞系中分選出表達CD133標記的細胞亞群，這些細胞較不表達CD133的細胞具有更高的克隆能力和增殖活性，接種于免疫缺陷小鼠后具有更高的腫瘤形成能力，提示表達CD133的乳腺癌細胞具有腫瘤干細胞的特性。本實驗中干細胞標記CD133陽性率為40.30%，與傳統(tǒng)乳腺癌干細胞標記陽性率相近，但其三陰性乳腺癌中的陽性率較非三陰性乳腺癌高。本研究與Lehmann等[14]的研究結(jié)果相似，他們通過對587例三陰性乳腺癌患者的基因分析，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌特異性表達干細胞標記。在三陰性乳腺癌中，特異性表達CD133的癌細胞或許是乳腺癌干細胞。

有研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以通過EMT獲得干細胞樣特征，Salnikov等[15]在胰腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)，低氧刺激細胞發(fā)生EMT，而發(fā)生EMT的細胞在干細胞標記高表達的細胞中比例較高。高表達干細胞標記的細胞，低表達或是不表達上皮標記E-cadherin[15]。我們在乳腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，在本實驗中，CD133、Nestin在E-cadherin陰性組中的陽性率均高于E-cadherin陽性組。發(fā)生EMT的腫瘤組織，細胞失去極性，出現(xiàn)E-cadherin表達的缺失。干細胞標記CD133、Nestin在發(fā)生EMT的乳腺癌組織中表達率更高，提示乳腺癌組織表達干細胞表型可能與腫瘤組織發(fā)生EMT有關(guān)。

Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)，通過敲除Nestin基因，能明顯上調(diào)E-cadherin的表達，同時逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的EMT過程。Nestin在乳腺癌中的表達率較高，通過抑制Nestin的表達來逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的EMT過程，或許可以成為靶向干細胞治療乳腺癌的新方向。而CD133在三陰性乳腺癌表達率較高，抑制CD133的表達，或許可以為三陰性乳腺癌的治療提供新方向。

綜上所述，Nestin可以用來特異性檢測乳腺癌干細胞的表達，而CD133可以用于特異性檢測三陰性乳腺癌中干細胞的表達。干細胞標記CD133、Nestin在發(fā)生EMT的乳腺癌組織中表達率更高，提示腫瘤細胞可以通過EMT獲得干細胞樣特征。通過抑制Nestin的表達可能可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌的EMT過程，成為乳腺癌靶向干細胞治療的新方向。三陰性乳腺癌目前尚無相關(guān)靶向治療藥物，因此抑制三陰性乳腺癌中CD133的表達或許可以成為三陰性乳腺癌靶向治療的新方向。

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Relations between the expression of CD133,Nestin in breast cancer and epithelial-mesenchymal transition.

HUANG Si-nian1,CHENG Mei-hong1,TAN Yun-shan2,YAO Jun-xia1,JING Hong-yan1.1.Department of Pathology,Qingpu branch,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 201700,CHINA;2.Department of Pathology,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200032,CHINA

Objective To investigate the Nestin and CD133 expression in breast tumors and analyze the relationship between them and epithelial-mesenchymal transition(EMT).Methods A total of 67 samples of breast cancer were collected from Qingpu branch,Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University from January 2010 to June 2013.Immunohistochemical staining was performed on these samples.Results Nestin expression was observed in 73.13%(49/67)cases.CD133 expression was observed in 40.30%(27/67)cases.Nestin expression in the triple-negative breast cancers was observed in 90.48%(19/21)cases,and Nestin expression in the other cancers was observed in 65.22%(30/46)cases,there was no significant difference between them(P＞0.05).CD133 expression in the triple-negative breast cancers was observed in 71.43%(15/21)cases,and CD133 expression in the other cancers was observed in 26.09%(12/46)cases,there was significant difference between them(P＜0.01).The expression rates of Nestin and CD133 in the E-cadherin-negative breast cancers were 95.83%(23/24)and 58.33%(14/24),which was significantly higher than 60.47%(26/43)and 30.23%(13/43)in the E-cadherin-positive breast cancers(P＜0.01).Conclusion Nestin might be a new sensitive marker for breast cancer stem cells.CD133 might be a new special marker for breast cancer stem cells.The higher expression of Nestin and CD133 in breast cancers that undergo EMT,which have demonstrated an association between EMT and acquisition of stem cells phenotype.

Breast cancer;Triple-negative breast cancers;Nestin;CD133;Epithelial-mesenchymal transition(EMT)

R737.9

A

1003—6350（2017）19—3099—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.19.002

上海市青浦區(qū)科委基金(編號：青科發(fā)2011-34)

程美紅。E-mail：45087556@qq.com

2017-04-10)