陳小林，顏 群*，李瑞芳，李焜華，韋善富，黃鳳寬，韋麗麗

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

廣西稻瘟病菌生理小種鑒定及遺傳多樣性分析

陳小林1,2，顏 群1,2*，李瑞芳1,2，李焜華1,2，韋善富1,2，黃鳳寬1,2，韋麗麗1

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣西 南寧 530007；2.廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【目的】明確廣西稻瘟病菌生理小種組成及遺傳結(jié)構(gòu)，為今后水稻抗病品種的選育和布局提供依據(jù)?！痉椒ā坷梦覈?guó)7個(gè)稻瘟病菌鑒別品種和SSR對(duì)廣西2012～2014年分離獲得的稻瘟病菌單孢菌株分別進(jìn)行生理小種鑒定和遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】2012-2014年分離獲得的142株稻瘟病菌菌株分成ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF、ZG 7群24個(gè)生理小種，其中優(yōu)勢(shì)種群為ZB，出現(xiàn)頻率67.61 %，優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB9和ZB13，出現(xiàn)頻率均為19.01 %。運(yùn)用UPGMA法對(duì)其中107個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，在0.88的相似水平上劃分為14個(gè)遺傳宗譜。其中，宗譜L01為優(yōu)勢(shì)宗譜，占供試菌株比例為44.86 %；其次為宗譜L03、L06和L11，占供試菌株比例分別為19.63 %、13.08 %和10.28 %。對(duì)每個(gè)遺傳宗譜所包含的菌株及對(duì)應(yīng)生理小種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌遺傳宗譜與生理小種之間未存在相關(guān)性。【結(jié)論】2012-2014年廣西稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)種群為ZB，優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB9和ZB13，其遺傳宗譜與生理小種之間未存在相關(guān)性。

水稻；稻瘟病菌；生理小種；遺傳多樣性；SSR

1 材料與方法

1.1 供試品種

我國(guó)7個(gè)水稻稻瘟病菌鑒別品種分別為：特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18及麗江新團(tuán)黑谷。

1.2 稻瘟病標(biāo)樣采集及病菌分離

于2012-2014年在廣西桂中、桂南、桂北和高寒山區(qū)等稻作區(qū)隨機(jī)采集的水稻穗頸瘟標(biāo)樣46份，采用孢子振落法[13]分離獲得單孢菌株142個(gè)，接種到滅菌后約0.5 cm長(zhǎng)的稻節(jié)中培養(yǎng)，產(chǎn)孢后于干燥處保存。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水定容至1000 mL，自然pH，121 ℃濕熱滅菌20 min；不加瓊脂為PDB液體培養(yǎng)基。

稻瘟病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基[21]：新鮮紫鴨跖草剪成約1 cm長(zhǎng)片段，放入三角瓶中，每瓶15～20 g，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.4 SSR引物

參照劉二明等[22]篩選的13對(duì)SSR引物：A5、D4、D5、G5、KMS02、KMS20、SMS17、FG01、FG02、 FG03、MS355、MS363、MS677，引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 菌株來(lái)源Table 1 The origin of strains

1.5 孢子懸浮液的制備

將保存的菌株轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)約7 d，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，挑取適量菌絲體，接種于產(chǎn)孢培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d后，每個(gè)三角瓶加無(wú)菌水50 mL，用紗布濾掉菌絲及培養(yǎng)基，配制成孢子濃度為1×105～3×105CFU/mL用于人工接種。

1.6 苗期人工接種

將7個(gè)鑒別品種種子浸種48 h，置于28 ℃恒溫催芽24 h，按順序播于同一瓷盤中，每個(gè)品種播10～15粒種子，常規(guī)管理，接種前3～5 d追施尿素1次，每盤4 g。待秧苗長(zhǎng)至3～4葉時(shí)，均勻噴霧孢子液，接種量以所有葉片布滿孢子液為標(biāo)準(zhǔn)，接種后置于28 ℃黑暗條件下保濕24 h，而后光暗交替，高保濕條件下誘導(dǎo)發(fā)病。每菌株接種2盆(2次重復(fù))。接種6～8 d后，參照全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)記載及劃分生理小種[23]。

1.7 DNA提取

從稻瘟病菌PDA平板上挑取適量菌絲接種到裝有PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min搖床，振蕩培養(yǎng)5～7 d，收集菌絲，采用SDS法[24]提取基因組DNA，并用Nano Drop的Spectrophotometer檢測(cè)DNA濃度，調(diào)節(jié)濃度至100 ng/μl備用。

1.8 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系含有正、反向引物(10 μM/L)各1 μl，10 μl 2×TaqPCR MasterMix，1 μl模板DNA，加ddH2O補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55～57 ℃(根據(jù)具體引物設(shè)定[22])退火1 min，72 ℃延伸1～2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，電壓80 V，1 h，電泳后在凝膠成像儀下觀察、拍照并記錄。

表2 廣西稻瘟病菌生理小種組成Table 2 Composition of physiological races of M.oryzae in Guangxi

1.9 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，建立SSR的0-1數(shù)據(jù)庫(kù)，每個(gè)樣品的電泳條帶，有則賦值為1，無(wú)則賦值為0，應(yīng)用NTSYSpc2.1軟件，UPGMA方法(unweighted pair group method with arithmetic means)進(jìn)行聚類分析[25]，構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西稻瘟病菌生理小種鑒定

對(duì)2012-2014年廣西不同稻作區(qū)采集分離的142個(gè)稻瘟病單孢菌株，采用7個(gè)中國(guó)鑒別品種進(jìn)行接種鑒定，結(jié)果顯示，142個(gè)稻瘟病單孢分離菌株分為7群24個(gè)生理小種(表2)，包括ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF和ZG群，出現(xiàn)頻率分別為13.38 %、67.61 %、4.93 %、7.04 %、1.41 %、3.52 %和2.11 %。鑒定的結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)種群為ZB，其次為ZA和ZD；優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB9和ZB13，出現(xiàn)頻率均為19.01 %。與顏群[17]等檢測(cè)的2006年廣西稻瘟病菌生理小種相比，優(yōu)勢(shì)種群未變，優(yōu)勢(shì)生理小種由原來(lái)出現(xiàn)頻率分別為25.1 %、19.42 %的ZB1和ZB9變成出現(xiàn)頻率為均19.01 %的ZB9和ZB13。

2.2 稻瘟病菌遺傳多樣性分析

2.2.1 供試菌株的PCR擴(kuò)增 13對(duì)SSR引物對(duì)107個(gè)分離菌株進(jìn)行了有效擴(kuò)增，不同引物擴(kuò)增的菌株呈現(xiàn)不同的多態(tài)性。KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363和MS677分別擴(kuò)增出181、121、109、105、281、116、201、148、186、115、130和153條亮帶，表明107個(gè)稻瘟病菌株遺傳具有多樣性、復(fù)雜性。部分代表性擴(kuò)增結(jié)果如圖1。

M：DNA ladder；1～12：供試菌株 圖1 引物KMS20、A5、KMS02對(duì)部分公司菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Products of part of M.oryzae isolates by primer KMS20,A5 and KMS02,respectively

2.2.2 稻瘟病菌群體的遺傳組成 從107個(gè)供試菌株進(jìn)行聚類的結(jié)果(表3)可見(jiàn)，107個(gè)菌株在0.88的相似水平下被分成14個(gè)宗譜，其中L01為優(yōu)勢(shì)宗譜，包含48個(gè)菌株，占供試菌株比例為44.86 %；其次為宗譜L03、L06和L11，分別包含21、14和11個(gè)菌株，占供試菌株比例分別為19.63 %、13.08 %、10.28 %；其余10個(gè)宗譜分別包含菌株為1～3個(gè)，占供試菌株總比例為12.15 %。

2.3 稻瘟病菌遺傳宗譜與生理小種的關(guān)系

對(duì)每個(gè)遺傳宗譜所包含的菌株及對(duì)應(yīng)生理小種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3)，結(jié)果表明稻瘟病菌遺傳宗譜與生理小種之間未存在相關(guān)性。同一宗譜內(nèi)有多個(gè)不同生理小種，如宗譜L01就包括ZA1、ZA9、ZB1、ZB3、ZB5、ZB9、ZB13、ZB29、ZC1、ZC13、ZD1、ZE3、ZF1和ZG1共14種生理小種共48個(gè)菌株。而同一種生理小種又聚在不同宗譜上，如ZA1的10個(gè)菌株分別聚在宗譜L01、L03和L06上，ZB1的12個(gè)菌株分別聚在宗譜L01、L03、L06和L11上，說(shuō)明用傳統(tǒng)的7個(gè)鑒別品種鑒定出的生理小種本身在遺傳組成上存在差異。

3 討 論

本研究對(duì)2012-2014年廣西26縣市稻區(qū)的稻瘟病菌142個(gè)單孢分離菌株進(jìn)行生理小種鑒定，菌株分成ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF、ZG共7群24個(gè)生理小種，ZB為優(yōu)勢(shì)種群，出現(xiàn)頻率67.61 %，ZB9和ZB13為優(yōu)勢(shì)生理小種，出現(xiàn)頻率均為19.01 %，與2006年廣西稻瘟病菌生理小種的組成[13]相比，優(yōu)勢(shì)種群未變，優(yōu)勢(shì)生理小種由原來(lái)出現(xiàn)頻率分別為25.1 %、19.42 %的ZB1和ZB9變成出現(xiàn)頻率為均19.01 %的ZB9和ZB13。本研究所用菌株均采自田間自然發(fā)病的穗頸瘟標(biāo)樣，采集地點(diǎn)多、寄主品種多樣，能夠很好的反映廣西田間稻瘟病菌的菌體結(jié)構(gòu)，而肖丹鳳等[15]研究結(jié)果表明，廣西局部稻區(qū)2011-2012年優(yōu)勢(shì)生理小種為ZA11、ZA7和ZA15，因其僅對(duì)廣西南寧地區(qū)分離的菌株進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)樣采集地點(diǎn)分布偏窄、測(cè)定菌株數(shù)量偏少，故難以全面反映廣西稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)生理小種；近10多年來(lái)ZB一直是廣西稻瘟病菌的優(yōu)勢(shì)種群，表明該地區(qū)水稻主栽品種與ZB群具有很好的親和性，利于其田間發(fā)生和流行。目前，含有不同稻瘟病抗性基因的單基因系IRBLK-KA(Pi-k)、IRBLKm-TS(Pi-km)、IRBL1-CL(Pi-1)、IRBLTA-RE(Pi-ta)和IRBL9-W(Pi-9)對(duì)廣西142個(gè)分離株的抗譜均大于70.00 %，說(shuō)明這些抗性基因仍具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可作為優(yōu)良的抗源在該地區(qū)水稻抗病育種中使用，或通過(guò)聚合不同抗性基因從而達(dá)到提高品種抗性的目的。

表3 稻瘟病菌菌株的遺傳宗譜Table 3 Genetic lineages of M.oryzae isolates

本研究利用13對(duì)SSR引物對(duì)107個(gè)單孢分離菌株進(jìn)行了有效擴(kuò)增，運(yùn)用UPGMA法對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，在0.88的相似水平上將其劃分為14個(gè)遺傳宗譜，表明這些菌株在遺傳組成上的復(fù)雜性。而對(duì)每個(gè)遺傳宗譜所包含的菌株及對(duì)應(yīng)生理小種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌遺傳宗譜與生理小種之間未存在明顯相關(guān)性，這與前人的研究結(jié)果較為一致[15,26]。由于大多數(shù)SSR引物都是中性的分子標(biāo)記，其多態(tài)性在一定程度上反映了病原菌基因組遺傳組成的差異，但不能很好地反映病原菌致病相關(guān)基因差異，而生理小種是根據(jù)水稻品種對(duì)菌株的抗、感反應(yīng)型劃分，反映病原菌無(wú)毒基因(AVR)和寄主(R)抗性基因的互作，因此可以考慮利用與病原菌無(wú)毒基因連鎖或無(wú)毒基因內(nèi)特異性分子標(biāo)記來(lái)分析其群體的遺傳多樣性。鄧其明[27]等分析了基于毒性相關(guān)基因序列的稻瘟病菌群體遺傳多樣性，揭示了9個(gè)區(qū)域稻瘟病菌群體遺傳規(guī)律及其與地理分布之間的關(guān)系，具有一定的參考意義。

4 結(jié) 論

2012-2014年廣西稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)種群為ZB，優(yōu)勢(shì)生理小種為ZB9和ZB13；其遺傳宗譜與生理小種之間未存在相關(guān)性。

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PhysiologicalRacesIdentificationandGeneticDiversityAnalysisofMagnaportheoryzaeinGuangxiProvince

CHEN Xiao-lin1,2,YAN Qun1,2*,LI Rui-fang1,2,LI Kun-hua1,2,WEI Shan-fu1,2,HUANG Feng-kuan1,2,WEI Li-li1

(1.Institute of Plant Protection,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Guangxi Nanning 530007,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests,Guangxi Nanning 530007,China)

【Objective】The present paper aims to figure out physiological races variation and genetic structure ofMagnaportheoryzaein Guangxi and providea basis for breeding and distribution of rice resistant varieties in the future.【Method】Physiological races identification with seven differential varieties and genetic diversity analysis with SSR ofM.oryzaefrom 2012 to 2014 in Guangxi were conducted in the present work.【Result】24 physiological races belonging to 7 groups which included ZA,ZB,ZC,ZD,ZE,ZF and ZG were identified from 142 isolates collected from 2012 to 2014.Among them,the predominant group was ZB with an occurrence frequency of 67.61 %,and the predominant races were ZB9and ZB13with an occurrence frequency of 19.01 %,respectively.The UPGMA method was used to analyze the genetic diversity of 107 isolates and 14 lineages at similarity coefficient of 0.88 were obtained.Among them,lineage L01 was the dominant lineage accounting for 44.86 % of the isolates,lineage L03,L06 and L11 were subordinate lineages accounting for 19.63 %,13.08 % and 10.28 % of the isolates,respectively.In addition,the number of isolates and their corresponding physiological race of every lineage was counted and the result showed that there was no correlation between genetic lineages and races.【Conclusion】Between the year of 2012 and 2014 in Guangxi,the predominant group ofM.oryzaewas ZB while the predominant races were ZB9and ZB13,and there was no correlation between genetic lineages and races.

Rice;Magnaportheoryzae; Physiological race; Genetic diversity; SSR

1001-4829(2017)4-0767-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.010

2016-12-19

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(水稻)項(xiàng)目(nycytxgxcxtd-01-04)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015GX NSFBA139106)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)及科技發(fā)展基金項(xiàng)目(2015YT36，2015YM24，桂農(nóng)科2016JM11)；廣西作物病蟲害生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(2016-ST-2)

陳小林(1982-)，女，廣西博白人，博士，助理研究員，主要從事水稻病害研究，E-mail：cxl19830807@163.com，*為通訊作者，顏 群，E-mail：56297244@qq.com。

S435.111.4+1

A

(責(zé)任編輯 陳 格)