焦文強，白獻曉，徐引弟，王克領，郎利敏，朱文豪，李海利，張青嫻，張立憲，游 一，王治方，許 峰

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

華北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異分析

焦文強，白獻曉*，徐引弟，王克領，郎利敏，朱文豪，李海利，張青嫻，張立憲，游 一，王治方，許 峰

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

為了解華北地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的遺傳變異情況，通過對2014—2016年從河南、河北、山東、山西4省采集的疑似豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病料進行檢測，將擴增得到的PRRS陽性樣品的ORF5基因進行測序，分析華北地區(qū)2014—2016年PRRSV的變異情況。結(jié)果表明，2014—2016年華北地區(qū)流行毒株與國內(nèi)外代表性毒株核苷酸同源性在84.6%～99.8%;抗原位點比對結(jié)果顯示，變異株中和表位第37—44位氨基酸為SH(I/L/F)QLIY(N/K)，誘騙表位27—30位氨基酸為(V/A)L(V/A)N；系統(tǒng)進化樹分析表明，以CH-1a為代表的變異株、以VR-2332為代表的經(jīng)典毒株以及NADC30毒株在華北地區(qū)同時存在?？梢?，華北地區(qū)PRRSV流行情況復雜。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒； ORF5； 序列分析； 進化

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)，仔豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的烈性傳染病[1-4]。該病于1987年首次在美國報道，之后迅速蔓延至世界上大多數(shù)養(yǎng)豬國家[5]。我國學者郭寶清于1996年首次從病料中分離到PRRSV，證實了PRRS在我國的存在[6]。2006年，我國大多數(shù)養(yǎng)豬省份暴發(fā)了以母豬高燒、流產(chǎn)為主要特征的高致病性藍耳病(HP-PRRS)，并一直延續(xù)至今，嚴重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，其病原被認定為PRRSV變異株[7-8]。

PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arterivirus)動脈炎病毒屬(Arteriviridae) 成員，分為2個基因型：以VR-2332株為代表的北美洲型和以LV株為代表的歐洲型。PRRSV基因組為單股正鏈RNA，長度約為15 kb，含9個開放閱讀框 (ORFs)，編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSPs) 和7個結(jié)構(gòu)蛋白(SP)。其中，ORF5編碼的GP5蛋白是變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，成為分析PRRSV遺傳變異和進化的首選對象[9-10]。接種疫苗是目前防控PRRS最有效的辦法，但PRRSV在免疫壓力下發(fā)生變異，規(guī)避中和抗體的中和作用。PRRSV整個生命周期中缺乏真核生物中復制酶5′—3′的校正作用，使得PRRSV基因組存在較大可能的錯配現(xiàn)象。此外，PRRSV普遍存在缺失、插入以及重組現(xiàn)象[11-13]，以及由于某種不確定因素導致病毒生命周期意外終止而產(chǎn)生大量的準種，使得PRRSV同源重組、變異、突變情況變得異常復雜[14-15]。同時PRRSV不同毒株間的交叉保護力非常差，且疫苗研發(fā)相對于病毒變異往往處于滯后的狀態(tài)。因此，針對PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白，如GP5進行遺傳變異檢測就顯得十分重要。

為深入了解華北地區(qū)PRRSV遺傳變異情況，對2014年11月至2016年8月從河南、河北、山西、山東規(guī)?；i場采集的樣品進行檢測，擴增PRRSV ORF5基因并進行測序分析，旨在為有效指導臨床PRRS的防控工作提供參考。

1 材料和方法

1.1供試病料

于2014年11月至2016年8月共采集河南、山西、河北、山東等地區(qū)疑似病料553份，包括肺臟、淋巴結(jié)、血液等。

1.2主要試劑

TaqDNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNA酶抑制劑、pMD18-T Simple載體、DL2000 Marker均購自大連寶生物工程有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司，瓊脂糖購自Oxoid公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設計

參考GenBank中已發(fā)表的PRRSV毒株ORF5序列的保守區(qū)序列，應用Primer Premier 5.0軟件設計引物，ORF5-F：5′-CCATTCTGGTGGCAATTTGA-3′， ORF5-R：5′-GGCATATATCATCACTGGCG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4PRRSVORF5基因的克隆與測序

按照Trizol試劑操作說明書提取疑似樣品的RNA，隨即合成cDNA，反應條件為42 ℃ 1.5 h，70 ℃ 10 min。以cDNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增結(jié)果，回收與預期大小一致的PCR產(chǎn)物，并與pMD18-T Simple載體連接，4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后挑取單克隆進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。使用Meg Align軟件將本研究得到的PRRSV序列與GenBank中收錄的PRRSV序列進行核苷酸和氨基酸的比對，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1PRRSVORF5基因的擴增結(jié)果

從圖1可以看出，PCR擴增PRRSV ORF5可得到750 bp大小的片段，符合預期大小。553份待檢樣品中，有127份樣品檢測為PRRSV陽性，陽性率高達22.97%。

M為DL 2000 Marker；1、2為待檢樣品圖1 PRRSV ORF5擴增結(jié)果

2.2PRRSVORF5基因序列比對

本研究得到的16株(HEB-HD、HENAN-JIAOZ、HENAN-XINX、HENAN-XINX3、HEN-AY、HEN-AY2、HEN-KF、HEN-NY2、HEN-NY、HEN-PDS、HEN-PY、HEN-XC、HEN-ZHUMD、HEN-ZK、SHANDONG-DM、SHANXI-JINC)PRRSV 毒株均為北美洲型，與國內(nèi)外分離毒株核苷酸同源性在84.6%～99.8%，與NADC30毒株核苷同源性在84.7%～96.4%(圖2)。

2.3PRRSVORF5抗原位點比對結(jié)果

從圖3可以看出，ORF5的突變主要集中在第3～17位氨基酸、第23～39位氨基酸、第121～128位氨基酸、第161～170位氨基酸。其中，位于第37—44位氨基酸的中和表位，第39位氨基酸I大多突變?yōu)長或者F，第44位氨基酸存在N→K的突變，其氨基酸為SH(I/F/L)QLIY(N/K)；位于第27—30位氨基酸的誘騙表位，其氨基酸為V(A)LA(V)N；第13位氨基酸中存在R→Q的突變。

圖2 ORF5核苷酸序列比對結(jié)果

圖3 PRRSV ORF5主要抗原位點比對結(jié)果

2.4基于PRRSVORF5構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

由圖4可知，本研究得到的毒株均為北美洲型毒株，且HEN-AY、HEN-NY、HENAN-XINX3與VR-2332毒株在一個分支，表明HEN-AY、HEN-NY、HENAN-XINX3屬于經(jīng)典毒株；HEN-PDS、HEN-PY、HENAN-JIAOZ、HENAN-XINX與NADC30毒株在一個分支，表明HEN-PDS、HEN-PY、HENAN-JIAOZ、HENAN-XINX為PRRSV NADC30毒株;其他毒株與CH-1a毒株在一個分支，均為高致病毒株。以CH-1a為代表的變異株、以VR-2332為代表的經(jīng)典毒株以及NADC30毒株同時存在，表明華北地區(qū)PRRSV流行情況日益復雜。

圖4 基于ORF5構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

將本研究得到的PRRSV ORF5核苷酸序列與國內(nèi)外毒株的序列進行比對，結(jié)果顯示，核苷酸同源性在84.6%～99.8%，分離到的流行毒株均為北美洲型毒株，且不同區(qū)域間的差異較大。R13被認為與PRRSV的毒力存在某種潛在的聯(lián)系，抗原位點的比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株第13位氨基酸發(fā)生了R→Q的突變，在NADC30毒株中也存在同樣的突變，該位點的突變與周峰等[16]的研究相一致。

位于第37—44位氨基酸的中和性抗原位點目前已經(jīng)確定存在于北美洲型PRRSV毒株中，中和抗體的識別位點是第38、42、43、44位氨基酸，而第39、40、41位氨基酸被認為是結(jié)合位點[17]。本研究結(jié)果顯示，分離株的中和抗體識別位點第44位氨基酸存在N→K突變，而中和抗體結(jié)合位點的第39位氨基酸存在I→L突變以及I→F突變。第27—30位氨基酸的誘騙表位可以推遲中和抗體的產(chǎn)生，其氨基酸為V(A)LA(V)N，這些氨基酸的突變對于表位的影響還有待于進一步研究[18]。這些位點的突變可能是PRRSV在疫苗壓力下產(chǎn)生的應變，也可能是病毒自身隨機重組產(chǎn)生，其突變可能導致中和抗體不能有效識別和結(jié)合PRRSV，從而導致免疫失敗。關于R13突變對于病毒毒力的影響，需要進一步研究。

系統(tǒng)進化樹分析顯示，HEN-AY、HEN-NY、HENAN-XINX3與VR-2332毒株處于一個分支，HEN-PDS、HEN-PY、HENAN-JIAOZ、HENAN-XINX與NADC30毒株處于同一個分支，其他毒株均為PRRSV高致病毒株。綜合上述情況，經(jīng)典毒株與高致病毒株同時存在，加之新近流行毒株NADC30的出現(xiàn)[19]，使得華北地區(qū)PRRSV流行情況日益復雜，PRRS的防控更加困難。針對目前這種復雜的情況，單一的針對經(jīng)典毒株、高致病毒株或者NADC30毒株的疫苗很難達到令人滿意的防控效果。采用基因工程方法，開發(fā)針對多種毒株、不同抗原位點的新型疫苗顯得極為迫切。

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Variation Analysis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Isolates in Northern China

JIAO Wenqiang,BAI Xianxiao*,XU Yindi,WANG Keling，LANG Limin,ZHU Wenhao,LI Haili, ZHANG Qingxian,ZHANG Lixian,YOU Yi,WANG Zhifang,XU Feng

(Institute For Animal Husbandary and Veterinary Research,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

In order to elucidate the evolution of the porcine reproductive and respiratory virus(PRRSV) in northern China from 2014 to 2016,suspicious samples collected from Henan,Hebei,Shandong and Shanxi province were subject to PRRSV diagnosis,the positive samples were further subject to RT-PCR to obtain the sequence of ORF5.The sequence acquired were further aligned with the ORF5 sequence available in GenBank to construct phylogenetic tree.Also,antigenic sites of ORF5 compared to those of other isolates to analyse whether the antigenic sites has changed or not.Sequence comparision showed that the homology of ORF5 gene obtained in the present study was up to 84.6%—99.8%.Antigenic site comparison showed that neutralizing epitipes of the HP-PRRSV located at 37—44 were SH(I/L/F)QLIY(N/K),decoy epitope located at 27—30 were (V/A)L(V/A)N.Phylogenetic tree showed that HP-PRRSV with the representive strain CH-1a,together with classic PRRSV represented by VR-2332 and NADC30 strain have been circulating in northern China.In conclusion,the PRRSV has been increasingly complicated.

porcine reproductive and respiratory syndromevirus(PRRSV); ORF5; sequence analysis;evolution

S855.3

A

1004-3268(2017)10-0128-04

2017-04-28

河南省科技攻關項目 (162102110050，162102110042)；河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目(2016ZC51，2017ZC49)

焦文強(1982-)，男，河南新鄉(xiāng)人，助理研究員，博士，主要從事分子病毒學方面研究。E-mail:wenqiangjiao@163.com

*通訊作者：白獻曉(1963-)，男，河南南陽人，研究員，主要從事動物傳染病診斷方面的研究。E-mail:1030410210@qq.com