黃小萌，張 超，武 麗，劉 兵，王俊麗，曹素英，高建明

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206）

小檗堿對豬卵母細胞體外成熟過程miRNA及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響

黃小萌，張 超，武 麗，劉 兵，王俊麗，曹素英，高建明*

（北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206）

本試驗旨在探明小檗堿（Berberine，Ber）對豬卵母細胞體外成熟的作用及其對miRNA表達差異和脂滴代謝相關(guān)基因的影響。吸取法獲取卵丘-卵母細胞復(fù)合體，0.1% 透明質(zhì)酸酶脫除顆粒細胞的未成熟卵母細胞為GV組，以TCM-199培養(yǎng)液為體外成熟液作為對照組，添加中藥單體成分Ber為Ber組，觀察卵母細胞成熟效果，基因芯片技術(shù)分析Ber對豬卵母細胞體外成熟過程中miRNA的差異變化，尼羅紅染色測定脂滴含量變化，RT-PCR檢測候選基因及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達含量。結(jié)果表明： Ber組卵母細胞顆粒細胞擴散率（P＜0.05）和第一極體排出率較對照組均差異顯著（P＜0.01）；相比于對照組和GV組間的差異miRNA，Ber組上調(diào)4個在卵母細胞成熟中差異表達的miRNA，下調(diào)1個miRNA；Ber組卵母細胞脂滴含量明顯少于對照組；Ber組卵母細胞中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因的表達均極顯著低于對照組（P＜0.01），且對照組卵母細胞極顯著低于GV組（P＜0.01）。Ber可能通過影響miRNA及脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，降低豬卵母細胞中脂滴的含量，進而促進豬卵母細胞體外成熟。

Ber；miRNA；卵母細胞；體外成熟；脂質(zhì)代謝；豬

卵母細胞質(zhì)量是胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)，豬在解剖、生理、病理等方面與人體極為相似，是適合醫(yī)學(xué)研究的常見動物模型[1]，因此，探明影響豬卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）質(zhì)量的影響因素具有重要意義。研究表明，在哺乳動物原始卵泡生長發(fā)育到成熟排卵過程中，需要miRNA的參與。Tesfaye等[2]對牛體外成熟卵泡研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細胞成熟過程中，miR-125a、miR-127、miR-145和miR-208的上調(diào)表達對卵泡發(fā)育具有重要作用。Qiyuan等[3]發(fā)現(xiàn)，在小鼠卵母細胞成熟過程中miRNA表達含量呈動態(tài)變化。與小鼠等其他哺乳動物相比較，豬卵母細胞miRNA的表達和功能研究分析相對較少，其作用機制尚不十分清楚。

Ber（Berberine，Ber）是從黃連種植物中提取的一種異喹啉生物堿化合物，有很廣的生物學(xué)效應(yīng)，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝[4]等作用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，將中藥單體成分Ber添加于胚胎培養(yǎng)液中，能調(diào)控小鼠附殖前胚胎抗調(diào)亡基因miR-21[5]，顯著促進小鼠體外培養(yǎng)的囊胚移植妊娠率和窩成活率[6]。因此，本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，添加Ber于TCM-199體外成熟液中，探索Ber對體外成熟豬卵母細胞作用以及豬卵母細胞成熟過程中miRNA的差異表達影響，從而提高卵母細胞體外成熟質(zhì)量，為卵母細胞體外成熟的研究和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 卵巢來源 從北京市沙河第五肉聯(lián)廠的屠宰車間采集新鮮的豬卵巢，置入35℃含雙抗的生理鹽水中，1 h內(nèi)運回實驗室。

1.2 豬卵母細胞體外成熟 采用吸取法獲取卵巢上3～6 mm卵泡中卵丘-卵母細胞復(fù)合體（Cumulus-Oocyte complexes，COCs）， 經(jīng) TL-HEPES-PVA液洗滌 3遍，體視顯微鏡下挑選卵丘細胞2層以上、致密、胞質(zhì)均勻的COCs，分別移入mTCM199成熟液中作為對照組，以及添加Ber（0.1 μg/mL，純度 ≥ 99.97%，中國藥品生物制品檢定所）的mTCM199成熟液作為Ber組，于39℃、5% CO2、95%空氣、100%相對濕度的CO2培養(yǎng)箱中體外培養(yǎng)44 h，其0～22 h添加0.5 μg/mL 促黃體素（LH）、0.5 μg/mL促卵泡素（FSH），而22～44 h不添加LH和FSH。IVM 44 h后，挑選顆粒細胞擴散3倍以上的COCs，用0.1% 透明質(zhì)酸酶脫除顆粒細胞，挑選排出第一極體的卵母細胞備用，并統(tǒng)計第一極體排出率。

1.3 豬卵母細胞miRNA差異表達分析 收集0.1% 透明質(zhì)酸酶脫除顆粒細胞后的胚泡（Germinal Vesicle，GV）期的未成熟卵母細胞為GV組，以及IVM 44 h的添加和未添加Ber的成熟卵母細胞（每組各500枚），保存于-80℃中，并存于干冰中送至上?？党缮锟萍加邢薰?，應(yīng)用Exiqon miRNA Array分析卵母細胞成熟中miRNA的差異表達，完成GO和pathway分析。

1.4 豬卵母細胞脂滴染色 按照試劑盒說明，將卵母細胞用PBS清洗后，置于稀釋后的GENMED染色液后，避光孵育10 min，將單個卵母細胞置于載玻片上，壓片后，激光共聚焦掃描顯微鏡（FV-1000,OLYMPUS,日本）下觀察熒光，Image J圖像分析軟件統(tǒng)計熒光面積。

1.5 RT-PCR驗證候選基因 分別收集GV期卵母細胞、IVM 44 h的添加和未添加Ber的成熟卵母細胞各100枚于1.5 mL離心管中，按照RNA提取試劑盒說明提取總RNA，按照PCR試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR。取12 μL RNA樣本，依次加入 5×Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2μL，Reverse Transcriptase Mix 2 μL ，制備 20 μL 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，混合均勻，37℃孵育60 min，95℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存。反應(yīng)在STRATAGENE熒光實時定量分析系統(tǒng)中按照miScript PCR Starter Kit試劑盒操作說明進行，GAPDH為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min；94℃變性15 s，55℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進行基因的相對定量。試驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件的單向方差分析和SNK多重比較法對數(shù)據(jù)進行分析和差異顯著性比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示無顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 Ber對豬卵母細胞體外成熟的影響 由表1可見，經(jīng)IVM 44 h，Ber組豬卵母細胞的顆粒細胞擴散率顯著高于對照組（P< 0.05），且Ber組卵母細胞第一極體排出率極顯著高于對照組（P < 0.01）。說明Ber能夠提高豬卵母細胞體外成熟率。

2.2 Ber對豬卵母細胞體外成熟過程中miRNA的差異表達 分別檢測GV期的未成熟卵母細胞、添加和未添加Ber的IVM 44 h的成熟卵母細胞中miRNA的差異表達。芯片結(jié)果顯示（圖1），相比于GV組，對照組93個miRNA上調(diào)（倍數(shù)≥2.0，下同），Ber組110個miRNA上調(diào)，其中共同上調(diào)miRNA 88個；對照組47個miRNA下調(diào)（倍數(shù)≤0.5，下同），Ber組50個miRNA下調(diào)，其中共同下調(diào)miRNA 39個。相比于對照組，Ber組上調(diào)miRNA 21個；下調(diào)miRNA 7個。相比于對照組和GV組間的差異miRNA，Ber組上調(diào)4個在卵母細胞成熟中差異表 達 的 miRNA（miR-542-3p、miR-192、miR-148b-5p和miR-331-5p）， 下 調(diào)1個miRNA（miR-18b）（表2）。

2.3 候選基因驗證結(jié)果 通過對miR-192、miR-542-3p、miR-18b及miR-9的 表 達 進 行RTPCR檢測，從而驗證芯片檢測結(jié)果的可靠性。RTPCR結(jié)果表示，Ber組卵母細胞中miR-192和miR-542-3p的表達均極顯著高于對照組和GV組（P<0.01），且對照組極顯著高于GV組（P<0.01）；Ber組卵母細胞中miR-18b的表達極顯著低于對照組（P<0.01），且對照組極顯著低于GV組（P<0.01）；Ber組卵母細胞中miR-9的表達極顯著高于GV組（P<0.01），但與對照間無顯著差異（P>0.05）（圖2-A）。與芯片檢測結(jié)果相比（圖2-B），RTPCR結(jié)果中miRNA的表達倍數(shù)略有不同，但其變化趨勢及顯著性一致，因此，基因芯片篩選的差異基因可靠有效。

表1 小檗堿對豬卵母細胞體外成熟的影響

芯片和RT-PCR結(jié)果均表明，Ber組卵母細胞中miR-192和miR-542-3p的表達均高于對照組和GV組，且對照組極顯著高于GV組，在上調(diào)的基因中，miRNA-192表達倍數(shù)和含量均最多。因此，推測miRNA-192對豬體外成熟卵母細胞體外成熟作用顯著。

2.4 差異表達miRNA的靶基因及通路分析 通過Pictar、miRscan、miRBase等預(yù)測軟件，對miR-542-3p、miR-192、miR-148b-5p、miR-331-5p及miR-18b靶基因進行預(yù)測并通過GO分析，從生物學(xué)進程（BP）、細胞組成（CC）以及分子功能（MF）這3部分進行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BP方面，靶基因功能主要集中在物質(zhì)代謝方面（包括基礎(chǔ)代謝、大分子代謝和細胞大分子代謝）（圖3-A）；在CC方面，靶基因主要富集在細胞及其內(nèi)外（圖3-B）；在MF方面，靶基因主要富集在物質(zhì)結(jié)合方面（包括蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等方面）（圖3-C）。通過對靶基因進行pathway預(yù)測，差異基因主要集中在PPAR、NF-kB等通路（圖4），且這些通路與細胞代謝和物質(zhì)代謝有著極密切的聯(lián)系。

圖1 miRNA的熱圖分析

2.5 Ber對豬卵母細胞脂滴代謝的調(diào)控作用 通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Ber可能參與了調(diào)控豬卵母細胞體外成熟過程中糖脂代謝過程，因此，應(yīng)用尼羅紅染色法對豬卵母細胞中脂滴進行熒光染色。由圖5可知，相比于GV組，對照組成熟卵母細胞中脂滴量顯著降低（P<0.05），Ber組極顯著降低（P<0.01），且Ber組脂滴量顯著低于對照組（P<0.05）。由此說明，在豬卵母細胞IVM過程中，脂滴逐漸減少，且添加Ber后，卵母細胞中脂滴的含量明顯減少?？梢夿er參與了豬卵母細胞中脂滴代謝過程。

圖2 不同組別卵母細胞中miR-192、miR-542-3p、miR-18b及miR-9的表達

表2 Ber處理后差異表達的miRNA

圖3 差異表達基因的GO分析

圖4 差異miRNA靶基因的pathway分析

圖 5 小檗堿對豬卵母細胞脂滴的影響

為確定Ber對豬卵母細胞脂滴的作用，檢測了與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因（脂肪酸結(jié)合蛋白，F(xiàn)ABP3、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，SREBP1）和預(yù)測的信號通路基因（過氧化物酶體增殖物激活受體，PPARγ），F(xiàn)ABP3、SREBP1和PPARγ的表達水平與脂質(zhì)合成呈正相關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示，Ber組卵母細胞中FABP3、SREBP1和PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著低于對照組（P<0.01），且對照組卵母細胞極顯著低于GV組（P < 0.01）（圖6）。因此，推測Ber可能通過影響miR-192表達，以及FABP3、SREBP1、PPARγ等基因的表達水平影響豬卵母細胞脂滴代謝，提高了卵母細胞成熟率。

圖6 小檗堿對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

3 討 論

脂滴是卵母細胞的主要儲能物質(zhì)，可以為胚胎發(fā)育提供能量。脂滴是一個復(fù)雜的多功能細胞器，參與物質(zhì)代謝、能量循環(huán)、信號傳導(dǎo)等過程。豬卵母細胞中存在大量的脂滴，且脂滴較難代謝，致使豬卵母細胞的耐凍性極差，其冷凍卵母細胞解凍后的存活率和生存能力均受到極大的損害。在豬卵母細胞體外成熟過程中，細胞質(zhì)內(nèi)脂滴的含量與未成熟卵母細胞相比明顯下降[7-8]，這與本試驗結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)，脂滴含量較多的豬卵母細胞IVF囊胚發(fā)育率僅為3.3%，與之相反，脂滴較少的卵母細胞體外受精囊胚發(fā)育率為16.4%[9]。Watanabe等[10]發(fā)現(xiàn)，在豬IVM液中添加促脂質(zhì)外流劑（甲基-β-環(huán)糊精）后，卵母細胞中脂滴含量下降，體外受精胚胎的卵裂率從69.6%提高至76.9%，囊胚發(fā)育率從9.5%提高至26.3%。本試驗通過向豬卵母細胞IVM液中添加Ber，發(fā)現(xiàn)卵母細胞中脂滴的含量明顯減少，成熟率顯著提高。推測Ber可能是通過調(diào)控脂滴代謝而促進豬卵母細胞體外成熟。

miRNA對生物體具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，但miRNA對卵母細胞成熟的作用卻存在較大的分歧。有研究發(fā)現(xiàn)，由于Dgcr8在卵母細胞和早期胚胎中低表達，致使miRNA發(fā)揮作用的通道被阻斷，從而miRNA在小鼠卵母細胞中不發(fā)揮作用[11]。還有學(xué)者認為在小鼠的卵子發(fā)生以及牛、豬卵母細胞成熟過程中，miRNA均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[12-14]。因此，miRNA與豬卵母細胞成熟關(guān)系值得探究。

本研究通過miRNA芯片技術(shù)比較了GV期未成熟卵母細胞、添加和未添加Ber的IVM卵母細胞中miRNA的差異表達，發(fā)現(xiàn)Ber能夠上調(diào)4個與卵母細胞成熟相關(guān)的miRNA（miR-542-3p、miR-192、miR-148b-5p和 miR-331-5p）， 下調(diào)1個miRNA（miR-18b）。其中，miR-542-3p和miR-192是變化倍數(shù)最大的2個miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，miR-542-3p能夠抑制腫瘤癌癥細胞增殖過程[15]，由于卵母細胞成熟過程中，細胞增殖和分化過程停滯，因此推斷，miR-542-3p有可能通過抑制卵母細胞增殖和分化，而為卵母細胞的成熟提供更多的物質(zhì)基礎(chǔ)；miR-192的功能研究較多的集中于脂質(zhì)代謝方面。Dionysios等[16]通過對小鼠長期飼喂高脂飼料，致使小鼠肥胖，檢測其脂肪組織中miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的脂肪組織內(nèi)，miR-192的含量明顯降低，因此，miR-192可能對脂肪形成和堆積產(chǎn)生抑制作用。而且，與飼喂普通飼料母鼠的后代相比，長期飼喂高脂飼料母鼠的后代成年時肝臟中的miR-192等多個與脂肪代謝相關(guān)的miRNA表達出現(xiàn)顯著下降[17]，由此說明，母體的脂肪代謝能力可能通過miRNA介導(dǎo)，而對后代的脂肪代謝功能產(chǎn)生影響。因此推測，miR-192可能是調(diào)節(jié)卵母細胞中脂質(zhì)代謝的重要基因。

為了確定Ber對豬卵母細胞脂滴的作用，本試驗檢測了與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因FABP3、SREBP1和PPARγ，發(fā)現(xiàn)3個基因表達水平與脂質(zhì)合成呈正相關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示，Ber組卵母細胞中3個基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著低于對照組。后期將針對miRNA相關(guān)基因?qū)ωi卵母細胞脂滴代謝及其質(zhì)量的影響機制進行深入研究。

4 結(jié) 論

Ber可能通過上調(diào)4個與豬卵母細胞成熟相關(guān)的miRNA（miR-542-3p、miR-192、miR-148b-5p和miR-331-5p）下調(diào)1個miRNA（miR-18b），降低豬卵母細胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因FABP3、SREBP1和PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高豬卵母細胞的體外成熟率。

致謝:

對于獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點實驗室；農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室給予的支持，謹(jǐn)致謝忱！

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Effects of Berberine on miRNA and Related Genes of Lipid Metabolism in Porcine Oocytes Matured in vitro

HUANG Xiao-meng, ZHANG Chao, WU Li, LIU Bing, WANG Jun-li, CAO Su-ying, GAO Jian-ming*

(Animal Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

To study the effects of berberine (Ber) on miRNA and related genes of lipid metabolism in porcine oocytes matured in vitro. Obtaining the cumulus oocyte complexes by the draw method , 0.1% hyaluronidase to remove granulosa cell of the immature oocytes as the GV group, GV porcine oocytes undergo in vitro maturation 44h, TCM-199 as control group and adding berberine as Ber group respectively, these groups oocytes were observed effects of matured in vitro and collected oocytes of GV, control and Ber group to proceed gene chip analysis. The content of lipid droplets were measured by Nile red staining, and RT-PCR was used to measure the related gene expression of lipid metabolism. Comparing with the control group, we found that granular cell proliferation rate ( P＜0.05) and the polar body I (PbI )formation rate(P＜0.01) were significantly increased. Comparing with the different expression miRNA of control group vs GV, Ber group up-regulated 4 miRNA and down-regulated 1 miRNA , and the GO and pathway analysis found that these miRNA mainly involved in metabolic process; The oocytes lipid content of Ber group significantly lower than that of the control;The lipid metabolism related genes expression all significantly lower than the control group (P＜0.01) and the control group significantly lower than GV oocytes (P＜0.01). Berberine through regulating miRNA and the related genes of lipid metabolism deceased porcine oocytes lipid content and improved the porcine oocytes matured in vitro.

Berberine; miRNA ; Oocytes; In vitro maturation; Lipid metabolism; Pig

S828.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-047

2017-08-01；

2017-08-24

國家自然基金項目（31572402）；科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-科研計劃（市級）重點項目（KZ201610020017）

黃小萌（1991-），女，內(nèi)蒙古人，碩士研究生，研究方向為動物胚胎生物技術(shù)，E-mail:1747484059@qq.com；并列第一作者：張超（1990-），男，北京人，碩士研究生，研究方向為動物胚胎生物技術(shù)，E-mail:Zhangchao46@163.com

* 通訊作者：高建明，E-mail：gjmbac@sohu.com