楊 妍 ， 房英姿 ， 逄賓賓 ， 曹榮峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

兔急性亞硝酸鈉中毒病診斷方法的篩選

楊 妍 ， 房英姿 ， 逄賓賓 ， 曹榮峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

為找出診斷動物急性亞硝酸鈉中毒病更簡便、快速、準(zhǔn)確的方法，試驗先用9只兔，篩選建立中毒模型所需靜脈注射亞硝酸鈉的劑量；再取9只兔分別經(jīng)耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重，在注藥前及注藥后10、20 min和30 min取兔眼液、血液和尿液，用5種顯色法檢測亞硝酸鈉含量，用試劑盒檢測血中高鐵血紅蛋白的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中毒兔血清和尿液的亞硝酸鈉與聯(lián)苯胺冰醋酸、安替比林、格里斯、1-萘胺和偶氮試劑都發(fā)生了顏色反應(yīng)；中毒兔眼液與偶氮試劑接觸迅速呈玫紅色；中毒兔血液高鐵血紅蛋白占17.68%～38.19%。結(jié)果表明，偶氮眼瞼擦拭法可作為亞硝酸鈉中毒病的定性診斷法；血液和尿液中亞硝酸鈉含量采用格利斯法檢測更靈敏；用試劑盒法檢測血液高鐵血紅蛋白升高，也可作為亞硝酸鈉中毒的參考指標(biāo)。

兔 ； 亞硝酸鈉中毒 ； 格利斯法 ； 偶氮試劑法

亞硝酸鹽中毒是各種動物因誤食硝酸鹽含量高的飼料或飲水，在體內(nèi)或體外形成亞硝酸鹽進入血液，使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白而失去攜氧能力，導(dǎo)致組織缺氧而引起的一種常見中毒病。臨床上以突然發(fā)病、呼吸困難、黏膜發(fā)紺、血液褐變和痙攣抽搐為特征。實驗室診斷該病主要用顯色試劑檢測剩余飼料、嘔吐物或胃內(nèi)容物中，以及血液、尿液和其他體液中亞硝酸鹽的含量，或者測定血中高鐵血紅蛋白含量等方法。在獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)教學(xué)實驗課上，僅用聯(lián)苯胺冰醋酸顯色法來驗證檢測結(jié)果，一般不對安替比林、格利斯、1-萘胺和偶氮試劑顯色效果進行比較。但是由于聯(lián)苯胺冰醋酸顯色試驗結(jié)果并不明顯，操作也不方便，所以，擬通過建立家兔急性亞硝酸鈉中毒模型，并增加眼液現(xiàn)場快速診斷法和血中高鐵血紅蛋白含量測定法，來篩選出臨床上最佳的診斷方法，為動物急性亞硝酸鈉中毒病更簡便、快速、準(zhǔn)確地診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 比利時兔18只，體重1.9～2.4 kg，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心提供。適應(yīng)性飼喂14 d后開始試驗，期間自由飲水，飼喂固體飼料。

1.2 試劑和設(shè)備 722G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司)；離心機(SIGMA公司)；心電監(jiān)護儀(MIDMARK)；高鐵血紅蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)；1-萘胺(Sigma)、N-1-萘乙二胺(上海展云化工有限公司)；安替比林(克拉瑪爾試劑)，亞硝酸鈉(萊陽康德化工有限公司)；鹿眠寶(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)贈送)；10%亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、聯(lián)苯胺冰醋酸試劑、安替比林試劑、格利斯試劑、1-萘胺試劑和偶氮試劑按照《獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實驗教程》[3]配制。

1.3 試驗設(shè)計和動物分組 將9只兔子自由分3組，每組3只。稱重后，皮下注射鹿眠寶0.06 mL/kg體重，分別經(jīng)兔耳緣靜脈注射亞硝酸鈉80 mg/kg體重、120 mg/kg體重和160 mg/kg體重。連接心電監(jiān)護儀監(jiān)控中毒前后體溫、脈搏、呼吸數(shù)和血壓等的變化，觀察兔的癥狀表現(xiàn)，確定兔急性亞硝酸鈉中毒模型的最佳劑量。

將9只兔稱重，耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重。在注藥前及注藥后10、20 min和30 min，分別測體溫、心率、呼吸數(shù)，記錄臨床癥狀，采血取血清，導(dǎo)尿管取尿液1 mL，棉簽擦拭眼液。

1.4 眼液顯色診斷兔急性亞硝酸鈉中毒試驗 在注藥前及注藥后10、20 min和30 min，用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽蘸取眼液部位上分別滴加5種顯色液2滴，隨即觀察棉簽顏色變化并記錄。

1.5 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗

1.5.1 不同濃度的亞硝酸鈉與5種顯色劑體外顯色反應(yīng) 取白瓷板分別滴加0.1、1、10、100 μg/mL 亞硝酸鈉溶液2滴，另取對應(yīng)孔滴2滴生理鹽水做空白對照，再分別滴加聯(lián)苯胺冰醋酸、安替比林、格里斯、1-萘胺和偶氮5種顯色劑各2滴。攪拌靜置1 min，觀察不同濃度亞硝酸鈉溶液與5種試劑反應(yīng)的顏色變化并記錄。

1.5.2 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗 分別取注藥前及注藥后10、20 min和30 min兔血清和尿液，白瓷板中分別與5種顯色試劑反應(yīng)，觀察顏色變化并與標(biāo)準(zhǔn)顏色反應(yīng)比對。

1.6 急性亞硝酸鈉中毒兔血中高鐵血紅蛋白的含量變化 耳緣靜脈采注藥前及注藥后10、20 min和30 min兔血，肝素抗凝，2 h內(nèi)用高鐵血紅蛋白試劑盒，測定急性亞硝酸鈉中毒前后兔血液高鐵血紅蛋白含量變化情況。

2 結(jié)果

2.1 兔急性亞硝酸鈉中毒模型的建立 兔耳緣靜脈注射亞硝酸鈉80 mg/kg體重、120 mg/kg體重和160 mg/kg體重，觀察兔的癥狀表現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉80 mg/kg體重組，3只兔無異常癥狀表現(xiàn)，生理指標(biāo)也無變化，未經(jīng)治療一直存活；160 mg/kg體重組，10 min內(nèi)3只兔全部死亡，僅出現(xiàn)瀕死期呼吸困難、結(jié)膜發(fā)紺、抽搐等癥狀，尸體剖檢僅見主動脈充盈、動脈血發(fā)紺的變化，生理指標(biāo)突然極度紊亂；注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重，3只兔逐漸出現(xiàn)呼吸急促、抽搐、結(jié)膜發(fā)紺和耳廓血管顏色變深等癥狀，通過心電監(jiān)護儀能夠發(fā)現(xiàn)脈搏和呼吸數(shù)增高，體溫降低和血壓不穩(wěn)，中毒后1～2 h死2只，另1只耐受。所以，確定兔急性亞硝酸鈉中毒模型接毒方法是耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重。

2.2 急性亞硝酸鈉中毒前后兔臨床癥狀、體溫、心率和呼吸數(shù)的變化 對9只兔經(jīng)耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重 10 min后，觀察發(fā)現(xiàn)，兔逐漸出現(xiàn)四肢無力、抽搐，瞳孔散大，耳廓血管顏色變?yōu)榘底仙?，結(jié)膜顏色由粉紅色變?yōu)榘l(fā)白、發(fā)紺。呼吸數(shù)在中毒后的10 min增大，中毒后20 min和30 min時略減少，體溫持續(xù)降低，心率持續(xù)增加，但體溫、心率和呼吸數(shù)與中毒前比較差異均不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 兔急性亞硝酸鈉中毒前后體溫、呼吸數(shù)和心率

2.3 眼液顯色診斷兔急性亞硝酸鈉中毒試驗 在注藥前用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽分別滴加5種顯色液2滴，隨即觀察發(fā)現(xiàn)，兔眼液均未發(fā)生顏色變化。

注藥后10、20 min和30 min，分別用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽滴加5種顯色液2滴，觀察棉簽顏色變化發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯胺冰醋酸出現(xiàn)淺棕色，安替比林肉眼無法判斷顏色變化，格里斯出現(xiàn)淺粉色但有的無顏色變化，1-萘胺肉眼無法判斷顏色變化，滴加偶氮試劑均出現(xiàn)明顯的玫紅色(見中插彩版圖1)。

2.4 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗

2.4.1 不同濃度的亞硝酸鈉與5種顯色劑體外顯色反應(yīng) 0.1、1、10、100 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液與5種顯色試劑的反應(yīng)結(jié)果(見中插彩版圖2)。隨著亞硝酸鈉濃度的增大，聯(lián)苯胺冰醋酸由無色變?yōu)闇\黃色至棕紅色；安替比林顯色不明顯，最后呈淡綠色；格里斯試劑從無色變?yōu)榉奂t至紫紅色，顯色明顯；1-萘胺試劑從無色變?yōu)槊导t色至橙紅色；偶氮試劑從無色變?yōu)闇\粉至粉紅最后為深洋紅色。

2.4.2 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗 在注藥前取兔尿液、血清與5種試劑接觸無顏色變化，而注藥后10 min、20 min、30 min，尿液、血清與5種試劑除安替比林試劑顏色變化不明顯，其他均顯色明顯，尤其以格里斯試劑呈明顯紫紅色(見中插彩版圖3、圖4)。

2.5 急性亞硝酸鈉中毒兔血液高鐵血紅蛋白的含量變化 將采集的抗凝血在2 h內(nèi)用高鐵血紅蛋白試劑盒測定急性亞硝酸鈉中毒前后兔血液高鐵血紅蛋白含量。中毒后兔血液呈醬油色，血紅蛋白含量降低，然后升高最后降低；高鐵血紅蛋白百分比顯著升高(見表2)。

表2 急性亞硝酸鈉中毒兔血液高鐵血紅蛋白含量

*：與中毒前相比有極顯著差異(P<0.01)

3 討論

3.1 淚液棉簽定性診斷法的比較 用淚液棉簽偶氮法快速診斷豬亞硝酸鹽中毒試驗發(fā)現(xiàn)，中毒后棉簽顏色隨時間的延長逐漸加深，由淺紅色變?yōu)槊导t色最后為棕紅色[2]，結(jié)合《獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實驗教程》中介紹不同染色試劑可以與血清中亞硝酸鈉反應(yīng)[3]，據(jù)此我們設(shè)計棉簽蘸取眼液后分別滴加5種試劑結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔在注射亞硝酸鈉后10～30 min內(nèi)，沾取眼液的棉簽滴加偶氮試劑后均顯現(xiàn)玫紅色，而聯(lián)苯胺冰醋酸和格里斯試劑顏色變化不明顯，安替比林和1-萘胺試劑肉眼無法判斷顏色變化。其中偶氮試劑作用原理是在酸性條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酰胺進行重氮化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與1-萘胺作用，生成深紅色偶氮染料[4]，雖然都是1-萘胺反應(yīng)，但條件不同其顏色也不同。說明偶氮法檢測淚液能夠定性快速診斷亞硝酸鈉中毒。

3.2 中毒兔血清和尿液顯色法的比較 研究報道，格里斯法定量檢測亞硝酸鈉最低限量為0.1μg/mL[5]，本試驗給兔注射亞硝酸鈉含量為120 mg/kg體重，試驗結(jié)果是除安替比林試劑顏色變化不明顯外，其他試劑均呈現(xiàn)明顯的顏色變化，尤其以格里斯試劑呈紫紅色，變化更明顯。根據(jù)體重和血液含量推算其血清中亞硝酸鈉含量約為600 μg/mL，而經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)已知濃度亞硝酸鈉溶液反應(yīng)的顏色對比，其亞硝酸鈉濃度在100 μg/mL左右，說明亞硝酸鈉進入體內(nèi)會發(fā)生一系列吸收或代謝等生物學(xué)反應(yīng)，其定量結(jié)果與體外試驗有差別。

本試驗進一步發(fā)現(xiàn)，兔亞硝酸鈉中毒10～30 min，其尿液與試劑均發(fā)生顯色反應(yīng)，其中10 min左右就出現(xiàn)，說明靜脈注射亞硝酸鈉能迅速到達腎臟，經(jīng)腎小球過濾而出現(xiàn)在尿液中。試驗發(fā)現(xiàn)，尿液與聯(lián)苯胺冰醋酸試劑反應(yīng)后的顏色與兔尿顏色相似，所以聯(lián)苯胺冰醋酸試劑不適合檢測尿液中的亞硝酸鹽。

4 結(jié)論

耳緣靜脈注射120 mg/kg體重亞硝酸鈉溶液，成功建立兔急性亞硝酸鈉中毒模型；偶氮試劑眼瞼擦拭法操作簡單，可以作為定性診斷的方法；血液和尿液中亞硝酸鈉含量采用格利斯法檢測更靈敏；測定血液中高鐵血紅蛋白含量，可作為亞硝酸鈉中毒的參考指標(biāo)。

[1] 貝懷國.實驗性大鼠亞硝酸鹽中毒與治療試驗[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2015, 05:8-10.

[2] 李鳳周,張玉清,蘇振山,等. 淚液棉簽偶氮法快速診斷豬亞硝酸鹽中毒試驗[J]. 養(yǎng)豬, 1995, 01:31-33.

[3] 唐兆新. 獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實驗教程[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006.

[4] 沈婕,王林萍. 急性亞硝酸鹽中毒76例臨床分析[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(12):1 668.

[5] 朱新鵬. 食品中亞硝酸鹽檢測的研究進展[J]. 保鮮與加工, 2011, 03:48-51.

S829.1

B

0529-6005(2017)08-0078-03

2016-12-26

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程項目(XJG2015117, XDSJP2015002)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生案例庫建設(shè)項目(750/1115008)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊(SDAIT-09-14)

楊妍(1989-)，女，碩士，研究方向為動物生殖免疫與疾病防治方向，E-mail:262493859@qq.com

曹榮峰，E-mail:rfcao@126.com