于 慧， 王 好， 祖岫杰, 康學(xué)會(huì)， 楊炳坤, 劉艷輝, 周井祥

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130033)

鯉IL-10錦鯉皰疹病毒核酸疫苗聯(lián)合免疫效果的研究

于 慧1， 王 好1， 祖岫杰2, 康學(xué)會(huì)2， 楊炳坤2, 劉艷輝2, 周井祥1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130033)

本研究選用鯉IL-10，構(gòu)建pEGFP-N1-IL-10真核表達(dá)質(zhì)粒，分別進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)和免疫魚的試驗(yàn)，證明了重組質(zhì)粒在細(xì)胞中能成功表達(dá)，體內(nèi)免疫試驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，抗體水平會(huì)隨著免疫次數(shù)、劑量的增加逐漸升高，三免后第1周的抗體水平最高，隨后抗體水平逐漸下降。相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，pEGFP-N1-IL-10與核酸疫苗pIRES-ORF81聯(lián)合免疫所產(chǎn)生抗體水平明顯升高，但差異不顯著(P>0.05)。

錦鯉皰疹病毒 ； 鯉白細(xì)胞介素10 ； 核酸疫苗pIRES-ORF81

錦鯉皰疹病毒病(Koi herpesvirus disease, KHVD)是能夠使鯉(Cyprinuscarpio)、錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)及其變種大量死亡的疾病，大面積暴發(fā)該病時(shí)，死亡率為80%～100%[1]。隨著全球水產(chǎn)品貿(mào)易迅猛發(fā)展，該病在世界范圍內(nèi)肆意傳播，難以控制，對(duì)鯉魚養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有一些預(yù)防錦鯉皰疹病毒病疫苗的相關(guān)報(bào)道，且具有一定效果。

1989年 Fiorentino 等[2]首次發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素 10 (Interleukin-10，IL-10)。IL-10可以在很多細(xì)胞中產(chǎn)生， 如T 細(xì)胞亞群，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等。已獲得多種哺乳動(dòng)物的 IL-10 序列，以及非哺乳動(dòng)物，禽類、鰻魚、鱒魚、河豚魚等的IL-10 序列。目前認(rèn)為 IL-10 具有多種免疫活性，它可以誘導(dǎo)外周耐受和免疫抑制，還在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

本研究在核酸疫苗pIRES-ORF81作用的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的pEGFP-N1-IL-10真核表達(dá)質(zhì)粒與該核酸疫苗聯(lián)合，進(jìn)行同時(shí)免疫，來探究鯉IL-10對(duì)于錦鯉皰疹病毒病發(fā)揮哪種免疫功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 150條250～300 g的健康鯉魚數(shù)尾(購(gòu)自長(zhǎng)春雙陽某漁場(chǎng))，平均體長(zhǎng)18 cm，試驗(yàn)前在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)魚室充氧的20 ℃水中飼養(yǎng)2周，研究中使用自然光周期。

1.2 主要試劑 多聚肌苷酸胞苷酸(PolyI:C)，購(gòu)自南京生利德生物技術(shù)有限公司； TRIZol?Reagent，購(gòu)至Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑、T4 DNA連接酶等，購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自AxyGen公司；L-15液體培養(yǎng)基、新生牛血清/胎牛血清，購(gòu)自HyClone公司。

1.3 細(xì)胞、病毒與質(zhì)粒 錦鯉皰疹病毒中國(guó)吉林株(KHV-CJ)由本實(shí)驗(yàn)室分離保存[3];框鏡鯉尾鰭原代細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室繁殖保存；核酸疫苗PpIRES-ORF81質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存[4]。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)鯉IL-10 mRNA基因序列(GenBank上登錄的)，引物設(shè)計(jì)使用Primer Premiers 5.0軟件，上游引物P1序列：5′-AAGCTTATGGTTTTCAGTGGAGTCATCCTTT-3′；下游引物P2序列：5′-GAATTCAATCACGAACGGAGAGAAACTAC-3′。劃線部分依次為限制性酶切位點(diǎn)HindⅢ和EcoRⅠ，送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。

1.5 IL-10基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定 試驗(yàn)前18 h對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行胞苷酸(500 mg/魚)注射，取新鮮鯉魚頭腎樣品及脾臟使用液氮對(duì)進(jìn)行其充分研磨使之成粉末狀，利用TRIZol法提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下: 94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，58.1 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束 4 ℃ 保存。將回收的IL-10目的基因與pMD-18T克隆載體16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)篩選鑒定后，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 IL-10基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒分別用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定和回收， T4連接酶16 ℃連接過夜，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，篩選克隆菌落接種至含卡那霉素的培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定雙重鑒定，選取陽性質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-IL-10。

1.7 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10在錦鯉鰭條細(xì)胞中的表達(dá)

1.7.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10的大量提取與純化 將含有pEGFP-N1-IL-10質(zhì)粒的菌液擴(kuò)搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行質(zhì)粒大提，方法參照AxyGen質(zhì)粒大量提取與純化說明書，使用分光光度計(jì)測(cè)定重組表達(dá)質(zhì)粒在260 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光值，根據(jù)重組表達(dá)質(zhì)粒的濃度計(jì)算公式：質(zhì)粒濃度(μg/μL)=OD260×稀釋倍數(shù)×50 μg/mL。

1.7.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10的轉(zhuǎn)染 用500 μL無血清培養(yǎng)基，分別稀釋3 μg重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10和9 μg EndoFectionTMMax轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻，室溫孵育5 min。在六孔板中，加入混勻的DNA-EndoFectionTM復(fù)合物，8字混勻后放入26 ℃培養(yǎng)箱孵育。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并采集圖片。分別提取細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后)總RNA，方法與提組織RNA相似，再進(jìn)行RT-PCR及PCR。

1.8 重組質(zhì)粒pEGFP-N1- IL-10與核酸疫苗聯(lián)合免疫魚試驗(yàn) 免疫試驗(yàn)前，將魚分6組，每組10尾，組1 滅菌的PBS；組2 空白對(duì)照組；組3 pIRES-ORF81；組4～6組pIRES-ORF81+pEGFP-N1-IL-10(劑量分別為1 μg、5 μg、15 μg)；注射劑量為200 μL/尾，三次免疫間隔14 d。尾靜脈采血于免疫前、一免及二免后第一、二周，三免后一到三周。收集血清，間接ELISA檢測(cè)抗體水平

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-10目的基因的擴(kuò)增及鑒定 分別以提取的鯉魚頭腎RNA及脾臟RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再分別以IL-10的P1，P2序列為引物，通過PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小一致的540 bp的目的片段，如圖1。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)pMD18-T-IL-10陽性質(zhì)粒(PCR鑒定)分別進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，在540 bp位置均有條帶，同時(shí)有一條2 000 bp以上條帶。與預(yù)期相符，說明成功構(gòu)建pMD18-T-IL-10，如圖2。

圖1 IL-10 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：PCR產(chǎn)物(IL-10)

圖2 雙酶切鑒定pMD18-T-IL-10

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：雙酶切產(chǎn)物(pMD18-T-IL-10)

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10鑒定 分別用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對(duì)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10進(jìn)行雙酶切。結(jié)果顯示的目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，在540 bp位置有條帶，同時(shí)有1條片段大小為4 645 bp的載體條帶。說明已經(jīng)成功將IL-10基因克隆到pEGFP-N1真核表達(dá)載體上，如圖3。

圖3 酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：pEGFP-N1-IL-10酶切結(jié)果

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10轉(zhuǎn)染至錦鯉鰭條細(xì)胞中，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到有質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞(如中插彩版圖4)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染情況 轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞用TRIZol裂解，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR，以cDNA作為模板，用P1，P2作為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。電泳后分別在位置540 bp處觀察到目的條帶，說明pEGFP-N1-IL-10已轉(zhuǎn)染成功，如圖5。

圖5 IL-10基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：IL-10PCR產(chǎn)物

2.5 鯉魚血清中抗體水平ELISA檢測(cè)結(jié)果 注射前要進(jìn)行一次采血，再向不同試驗(yàn)組鯉魚分別注射對(duì)應(yīng)的免疫劑，一免及二免后第1周和第2周，三免后第1～3周，尾靜脈采血。采用間接ELISA法檢測(cè)注射免疫劑后鯉魚血清中的抗體水平。通過平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算，最終得出圖中數(shù)據(jù)。圖6為結(jié)果，依圖所見，除了PBS組和空白組，其他各組鯉魚血清中均能檢測(cè)出KHV特異性抗體，免疫次數(shù)增多抗體水平隨之增加。三免后1周，抗體水平達(dá)到峰值，之后趨于下降。增加質(zhì)粒濃度抗體水平稍有增加，但不明顯。PBS組和空白組這兩組與注射重組質(zhì)粒組的抗體水平差異顯著(P<0.05)?；旌现苿﹑EGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81抗體水平有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；

圖6 不同劑量各組的血清抗體水平曲線

3 討論

IL-10是多效細(xì)胞因子，具有免疫刺激、免疫抑制雙重免疫調(diào)節(jié)活性。IL-10能夠促進(jìn)B細(xì)胞及天然殺傷性細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞及肥大細(xì)胞集落[5]。在免疫反應(yīng)中，IL-10能夠平衡組織損傷及阻止病原入侵，在對(duì)抗病原體的過程中能夠減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)組織免受過分的炎癥反應(yīng)損傷。因此該細(xì)胞因子具有一定的特殊性，目前，在許多哺乳動(dòng)物上已經(jīng)有過對(duì) IL-10 的研究，但是對(duì)于低等脊椎動(dòng)物 ，IL-10 的研究還很少。特別是關(guān)于鯉IL-10的報(bào)道十分有限[6]。馮祥汝等[7]通過研究IL-10 在鯉魚不同組織部位中的表達(dá)情況證明了IL-10 參與鯉魚的早期免疫反應(yīng)。

Segal B等[8],證明了在某些情況下，IL-10通過先天性免疫和適應(yīng)性免疫，也能夠?qū)盒约?xì)胞的免疫反應(yīng)產(chǎn)生積極作用。在接種抗癌疫苗之前給予 IL-10 能導(dǎo)致免疫抑制及腫瘤的形成，這與 IL-10 對(duì) DC 的抑制作用一致。但是，在免疫接種之后注射 IL-10 能明顯增強(qiáng)其抗腫瘤免疫效果。

并且，同時(shí)注射疫苗和 IL-10的動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)受過抗原刺激的 CTL水平明顯高于只注射了疫苗的動(dòng)物，表明IL-10 可以作為免疫佐劑維持 CTL 的水平。

本試驗(yàn)通過體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證明了構(gòu)建的真核質(zhì)粒pEGFP-N1-IL-10可在鯉魚鰭條細(xì)胞中表達(dá)，采用pEGFP-N1-IL-10+pIRES-ORF81、聯(lián)合免疫制劑對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行免疫，結(jié)果表明，抗體水平隨著免疫次數(shù)增多而有所增加，在三免后1周抗體水平趨于下降。3種劑量均獲得很好的免疫效果，且低劑量的核酸疫苗就可獲得較好的抗體水平。重組質(zhì)粒濃度增加，抗體水平隨之增加，結(jié)果是具有顯著差異的，由此可見，針對(duì)錦鯉皰疹病毒病，相比單一核酸疫苗pIRES-ORF81，聯(lián)合免疫制劑所產(chǎn)生的抗體水平更高，免疫效果更好，鯉IL-10可作為免疫佐劑以提高所接種疫苗的效果。

未來希望可以通過調(diào)控 IL-10 水平來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，但是由于該因子的特殊性，我們很難掌握免疫刺激和免疫抑制之間的平衡狀態(tài)，因此調(diào)節(jié)該細(xì)胞因子也具有較高的風(fēng)險(xiǎn)，我們必須掌握好最佳IL-10 的劑量以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。

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征訂啟事

2017年本刊征訂工作已結(jié)束，未在當(dāng)?shù)剜]局(所)訂到2017年本刊的讀者，可直接從郵局匯款至本刊編輯部訂閱。全年共12期，每期定價(jià)：16.00元，全年192.00元，不收郵費(fèi)。歡迎訂閱！編輯部地址：北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，電話：010-62733040，郵編：100193。

《中國(guó)獸醫(yī)雜志》編輯部

ImmuneeffectofcarpInterleukin-10andKoiHerpesvirusnucleicacidvaccinecombinedimmunization

YU Hui1, WANG Hao1, ZU Xiu-jie2, KANG Xue-hui2, YANG Bing-kun2, LIU Yan-hui2, ZHOU Jing-xiang1

(1.Institute of Animal Science and Technology of Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2.Jilin Academy of Fishery Sciences, Changchun 130033， China)

The eukaryotic recombinant plasmid pEGFP-N1-IL-10 were constructed based on IL-10 mRNA. In vitro cell transfection experiment , proved that the recombinant plasmid was successfully expressed in cells .ELISA results showed that antibody levels increased gradually with the increase of number and dose of immunization, The highest antibody level was on the first week after three immune. Then the antibody levels gradually declined. Compared with the single nucleic acid vaccine pIRES-ORF81, antibody levels in fish immunized with the combination of pEGFP-N1-IL-10 and nucleic acid vaccine pIRES-ORF81 increased , but it was not significant (P> 0.05).

Koi herpes virus ; Carp interleukin 10 ; Nucleic acid vaccine pIRES- ORF81

s:ZHOU Jing-xiang ； LIU Yan-hui

S942.5

A

0529-6005(2017)08-0083-04

2016-08-01

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-46-29)；吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20140101035JC)

于慧(1990-)，女，碩士生，從事動(dòng)物病毒分子學(xué)研究，E-mail：1150520227@qq.com

周井祥，E-mail：zhjxnd@126.com；劉艷輝，E-mail：liuyanhui9@163.com