董詩(shī)浩 張琪 王媛 董坤 譚墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明 650201）

東、西方蜜蜂工蜂對(duì)蜂王信息素的觸角電位反應(yīng)研究

董詩(shī)浩 張琪 王媛 董坤 譚墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明 650201）

在高度社會(huì)性的蜜蜂中，蜂王通過(guò)釋放信息素來(lái)表明自己的存在并影響蜂群的多種行為，如蜂王信息素可以作為性信息素吸引雄蜂、抑制新蜂王的培育及工蜂卵巢發(fā)育、吸引工蜂在蜂王周圍形成侍從圈并飼喂蜂王等。東、西方蜜蜂是親緣關(guān)系接近的姐妹種，兩種蜜蜂的蜂王信息素類似，即蜂王信息素具有保守性，但兩種蜜蜂的工蜂對(duì)蜂王信息素的感受性是否存在種間差異尚不清楚。觸角電位技術(shù)是一項(xiàng)用來(lái)測(cè)量昆蟲觸角敏感性的常用技術(shù)，通過(guò)測(cè)試工蜂觸角對(duì)相同的QMP混合物的電位反應(yīng)，就能得出工蜂觸角對(duì)QMP的敏感性大小。結(jié)果顯示，西方蜜蜂工蜂對(duì)蜂王信息素的敏感性高于東方蜜蜂工蜂，說(shuō)明東、西方蜜蜂對(duì)蜂王信息素的感受性確實(shí)存在種特異性，該研究有助于解釋東方蜜蜂的工蜂卵巢發(fā)育水平較高的原因。

工蜂；蜂王信息素；觸角電位

蜜蜂是社會(huì)性昆蟲，蜜蜂信息素是蜜蜂種內(nèi)化學(xué)通訊的重要媒介，蜜蜂的信息素種類較多，有蜂王信息素、引導(dǎo)信息素、示蹤信息素和報(bào)警信息素等。其中，蜂王信息素是指由蜂王上顎腺分泌的信息素（QMP），QMP有多種作用，包括抑制工蜂卵巢發(fā)育、抑制新蜂王的培育、吸引工蜂在蜂王周圍形成侍從圈并飼喂蜂王、吸引雄蜂與處女蜂王交配等[1-3]。不同種蜜蜂其QMP的成分有所不同，西方蜜蜂（Apis mellifera）的QMP研究最多，主要組分包括：反式9-氧代-2-癸烯酸（簡(jiǎn)寫為9-ODA）、9-羥基-2-癸烯酸（9-HDA）、對(duì)羥基苯甲酸甲酯（HOB）、4-羥基-3-甲氧苯基乙醇（HVA）、反式-10-羥基-2-癸烯酸（10-HDA）和10-羥基-癸酸（10-HDAA）[4]。后來(lái)又鑒定出4種與吸引工蜂作用相關(guān)的蜂王物質(zhì)新成分，分別是甲基油酸鹽（MO）、松柏醇（CA）、十六烷-1-醇（PA）和亞麻酸（LEA），但這四種物質(zhì)只有與其他幾種物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)才有作用，單獨(dú)物質(zhì)沒(méi)有作用[5]。大蜜蜂（A.dorsata）、小蜜蜂（A.florea）和黑小蜜蜂（A.andreniformis）的 QMP 僅包含 9-ODA、9-HAD、10-HDA和10-HDAA 4種組分，與西方蜜蜂親緣關(guān)系靠近的東方蜜蜂（A.cerana），其QMP除不含有HVA外，其它組分和含量都與西方蜜蜂類似[4,6]。QMP的一個(gè)重要作用是抑制工蜂卵巢發(fā)育，目前很多研究發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂的工蜂卵巢發(fā)育水平比西方蜜蜂工蜂更高[7-10]，但其中的原因一直未見(jiàn)報(bào)道。兩種蜜蜂的工蜂對(duì)QMP的敏感性不同可能是導(dǎo)致卵巢發(fā)育水平不同的原因，該研究通過(guò)比較東、西方蜜蜂工蜂對(duì)QMP混合物的觸角電位反應(yīng)，從而比較東、西方蜜蜂工蜂對(duì)QMP混合物的敏感性大小，研究結(jié)果有助于揭示東、西方蜜蜂的工蜂卵巢發(fā)育水平差異的原因。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)蜂群為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所飼養(yǎng)的東方蜜蜂和西方蜜蜂，每種蜜蜂各三群，均為正常有王群，群勢(shì)相當(dāng)，包括兩個(gè)子脾和兩個(gè)蜜粉脾。由于工蜂的嗅覺(jué)敏感性與發(fā)育水平關(guān)系密切，工蜂中采集蜂發(fā)育最成熟其嗅覺(jué)感受能力也強(qiáng)[11,12]，本研究中我們用采集蜂作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。測(cè)試前準(zhǔn)備幾個(gè)透氣性較好、能短期飼養(yǎng)蜜蜂的木盒，事先在木盒內(nèi)裝一些結(jié)晶蜂蜜，把木盒的開(kāi)口對(duì)準(zhǔn)蜂箱巢口，這樣出巢的采集蜂就進(jìn)入到木盒內(nèi)，木盒的蜜蜂吃到蜂蜜后很快安靜下來(lái)，將木盒的蜜蜂帶至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行EAG測(cè)試。

1.2 信息素

由于東方蜜蜂的QMP（Ac QMP）包括243 μg 9-ODA，33 μg 9-HDA，31 μg HOB，1.3 μg 10-HDA 和0.9 μg 10-HDAA，西方蜜蜂的QMP（Am QMP）包括237 μg 9-ODA，67 μg 9-HDA，26 μg HOB，1.2 μg 10-HDA，4 μg 10-HDAA 和 2 μg HVA（1 EQ），溶劑選擇具有高揮發(fā)性且對(duì)EAG反應(yīng)影響較小的二氯甲烷。根據(jù)比例配置Ac QMP和Am QMP混合物，所用試劑HOB，HVA和10-HDAA從阿拉丁試劑購(gòu)得，9-ODA和10-HAD通過(guò)化學(xué)方法合成，9-HAD通過(guò)化學(xué)方法從9-ODA制備而成。

1.3 EAG實(shí)驗(yàn)

測(cè)試前先做好EAG實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作。準(zhǔn)備好洗凈、烘干的濾紙條和巴斯德管。共需要三根巴斯德管作為氣味管，其中一根放入干凈的濾紙條作為對(duì)照組，另外兩根分別放入Ac QMP和Am QMP兩種混合物，QMP滴加在濾紙條上，待溶劑揮發(fā)完后將濾紙條迅速裝入巴斯德管內(nèi)，再把巴斯德管裝到EAG系統(tǒng)上。EAG系統(tǒng)使用的電極為玻璃電極，金屬絲為鉑絲，緩沖液為Ringer溶液，氣味刺激時(shí)間為3 s，刺激的間隔時(shí)間為30 s，連續(xù)氣流的速度為15 ml/s，刺激氣流的速度為5 ml/s，相對(duì)濕度為90%，前置放大器放大倍數(shù)為21倍[13]。調(diào)整好EAG系統(tǒng)，用鑷子從木盒中取出一只采集蜂，將蜜蜂的一只觸角從基部剪下，剪下的觸角迅速放到電極上，觸角基部連接參比電極，觸角頂端剪去很小的一部分并連接到記錄電極，待基線平穩(wěn)后開(kāi)始測(cè)試。測(cè)試順序?yàn)椋簩?duì)照組－Ac QMP－Am QMP，工蜂對(duì)QMP混合組分的EAG反應(yīng)值為QMP刺激的實(shí)際測(cè)量值減去對(duì)照組刺激的測(cè)量值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 東、西方蜜蜂工蜂對(duì)兩種蜂王信息素的觸角電位反應(yīng)

由圖1可知，Ac QMP的EAG反應(yīng)值要比Am QMP的小，同種蜜蜂進(jìn)行比較，西方蜜蜂工蜂對(duì)Am QMP的EAG反應(yīng)值要比Ac QMP的高 (Tukey’s HSD test,P＜0.05)，類似地，東方蜜蜂工蜂對(duì)Am QMP的EAG反應(yīng)值也比對(duì)Ac QMP的高。EAG反應(yīng)值越大，說(shuō)明敏感性越高，所以西方蜜蜂的工蜂對(duì)QMP的敏感性比東方蜜蜂工蜂更強(qiáng)。

3 討論

首先，Am QMP的EAG反應(yīng)值要比Ac QMP高；其次，不論Ac QMP還是Am QMP，西方蜜蜂工蜂都表現(xiàn)出更高的EAG反應(yīng)值，說(shuō)明在對(duì)QMP的感受性方面，西方蜜蜂工蜂具有比東方蜜蜂工蜂更高的敏感性。兩種蜜蜂的工蜂都對(duì)Am QMP的EAG反應(yīng)值高可能是因?yàn)锳m QMP比Ac QMP含有更多的9-HDA組分，此外比較Am QMP還包含了Ac QMP沒(méi)有的組分HVA，由于觸角電位測(cè)量的值是各個(gè)感覺(jué)器反應(yīng)值的總和，東、西方蜜蜂工蜂對(duì)這兩種組分中的任何一種或兩種組分有EAG反應(yīng)都可能導(dǎo)致這兩種蜜蜂的工蜂對(duì)Am QMP的EAG反應(yīng)值偏高。

導(dǎo)致東、西方蜜蜂工蜂觸角感受性差異的原因很多。首先，可能與觸角多樣化的形態(tài)和電生理特性有關(guān)，盡管東西方蜜蜂的觸角大小和表面積沒(méi)有明顯差異，但觸角上的感覺(jué)毛的分布和多種感覺(jué)器的數(shù)量卻有顯著不同；其次，氣味受體差異可能也是一個(gè)原因，已報(bào)道西方蜜蜂工蜂有160～170個(gè)氣味受體基因，而東方蜜蜂工蜂的氣味受體基因（119個(gè)）要比西方蜜蜂少很多[14]。

QMP的一個(gè)重要作用是抑制工蜂卵巢發(fā)育，東、西方蜜蜂的QMP主要成分含量類似，但是東方蜜蜂工蜂對(duì)QMP的敏感性比西方蜜蜂低，故受到QMP的抑制作用也較小，這在一定程度上解釋了東方蜜蜂工蜂的卵巢發(fā)育水平比西方蜜蜂工蜂的卵巢發(fā)育水平更高的原因。

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The research of electroantennogram responses of Apis cerana and Apis mellifera workers to queen mandibular pheromone

Dong Shihao,Zhang Qi,Wang Yuan,Dong Kun,Tan Ken
(Eastern Bee Research Institute of Yunnan Agricultural University,Kunming 650201)

In highly social bees,honey bee queens produce a pheromone,queen mandibular pheromone(QMP),which signals the queen’s presence and has multiple effects,such as QMP can act as a sex pheromone and attract drones to virgin queens,inhibition of queen rearing and prevention of worker ovary development,attract workers form a retinue around the queen and feed the queen.Apis cerana (Ac)has similar QMP to its sibling species Apis mellifera(Am),their QMP share an evolutionarily conserved set of QMP compounds,there is no evidence suggests there are species-specific sensitivity differences to QMP in the two honeybee sister species by now.To measure antennal sensitivities,we used electroantennograms(EAG),which are commonly used to measure olfactory stimulus sensitivity in honey bees,to compare the antennal responses to identical presentations of major component QMP.The results show that there were species-specific sensitivity differences for a blend of the major QMP,the antennal responses of Am workers were more sensitive than Ac workers,and this result provides an evidence for the phenomenon that Ac workers have higher levels of ovarian activation than Am workers.

workers;queen mandibular pheromone(QMP);electroantennogram(EAG)

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-45-KXJ14)

董詩(shī)浩（1988-），男，博士在讀，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)；張琪、王媛也并列為第一作者

譚墾，男，教授，博導(dǎo)，研究方向?yàn)槊鄯渖飳W(xué)，E-mail：kentan@xtbg.ac.cn