木 魁，李登坤，尚夢(mèng)婷，葛文武，高祥志，姜雙林*

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽 236037；3.亳州一中，安徽 亳州236800）

氧化石墨烯對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的毒性產(chǎn)生的劑量效應(yīng)

木 魁1,2，李登坤1,2，尚夢(mèng)婷1,2，葛文武3，高祥志1，姜雙林1,2*

（1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽 236037；3.亳州一中，安徽 亳州236800）

氧化石墨烯（GO）具有比表面積大、親水性、溶液分散性好等獨(dú)特的理化性質(zhì)，而日趨廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)。目前，在其低劑量下暴露細(xì)胞的生物安全性方面的報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)選取GO，并對(duì)其理化性質(zhì)表征。制備成濃度為0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL 使其暴露 24 h 在體外培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞 A549，檢測(cè)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT的活性，以及胞內(nèi)的蛋白含量，熒光染色檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧（ROS）的含量。MTT檢測(cè)24 h、48 h、72 h細(xì)胞活性。結(jié)果表明，GO暴露24 h，8μg/mL對(duì)A549的活性具有最高促進(jìn)作用。胞內(nèi)SOD、CAT活性顯著升高，蛋白含量增加，胞內(nèi)ROS、MDA的含量降低。結(jié)論是GO對(duì)A549細(xì)胞活性具有雙重性，低濃度下下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS，降低GO對(duì)A549的氧化損傷，從而提升細(xì)胞活性；高濃度下對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，抑制細(xì)胞活性。

氧化石墨烯；人肺腺癌細(xì)胞A549；細(xì)胞活性

氧化石墨烯（GO）憑借比表面積大、親水性、靈活性、溶液分散性好等獨(dú)特的理化性質(zhì)被日益廣泛的應(yīng)用在腫瘤光熱治療、細(xì)胞成像、抗菌、藥物輸送和基因轉(zhuǎn)染[1,2]。這些特點(diǎn)使得GO廣泛的使用必然增加與人類的接觸機(jī)會(huì)，尤其是呼吸系統(tǒng)，這也迫切需要對(duì)其生物安全性方面作出評(píng)估。

雖然有些研究表明GO具備生物安全性，但也有很多研究證明其存在危害性。這其中有很多不確定因素，比如橫向尺寸、厚度、所含官能團(tuán)種類和數(shù)量這些精確的理化性質(zhì)，以及暴露的GO的量，培養(yǎng)細(xì)胞的濃度等。Hu等[3]用20μg/mL和85μg/mL的GO暴露A549細(xì)胞24h，20μg/mL的GO對(duì)細(xì)胞無毒性，細(xì)胞略有減少，85μg/mL的GO細(xì)胞毒性增加，細(xì)胞減少50%。Chang等[4]研究表明，進(jìn)入不了A549細(xì)胞的GO無明顯毒性，高濃度的GO對(duì)A549細(xì)胞引起劑量依賴性氧化壓力，從而誘導(dǎo)細(xì)胞存活力的略微降低。然而在實(shí)際應(yīng)用過程中，多數(shù)使用的GO是低濃度的，高濃度的研究對(duì)應(yīng)用并沒有很高指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)通過體外對(duì)A549細(xì)胞暴露于低劑量GO下，分析各種生化指標(biāo)，得出低濃度GO對(duì)A549細(xì)胞的促進(jìn)作用。在體外模擬GO的生物安全性，從而為體內(nèi)GO的使用劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞（中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心饋贈(zèng)）、氧化石墨烯GO（中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心饋贈(zèng)）

1.2 試劑

A549細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基（南京建成生物工程研究所）、10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（南京建成生物工程研究所）、胰蛋白酶（Sigma）、噻唑藍(lán)（MTT，上海生工）、三聯(lián)溶解液（10%SDS，5%異丁醇，0.01 mol/L HCL）、超氧化物歧化酶（SOD）制劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）、活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、總蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GO的表征

原子力顯微鏡（AFM）和透射電鏡（TEM）表征GO的粒徑大小和形狀，傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀分析GO所包含的官能團(tuán)。

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在CO2為5%，溫度為37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

將GO用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋制成1mg/mL的濃儲(chǔ)備液，分別稀釋成終濃度為2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL及不加GO的完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞經(jīng)過0.25%的胰酶消化、離心、去上清、重懸、計(jì)數(shù)，密度制備成1×105個(gè)/mL，在96孔板上每個(gè)濃度設(shè)置四個(gè)重復(fù)和一個(gè)空白孔，分別培養(yǎng)24h，48 h，72h。每孔加入MTT10μL后繼續(xù)37℃孵育4h，加入三聯(lián)溶解液100μL再次37℃孵育4h，直接在570nm處用酶標(biāo)儀（Invitrogen）測(cè)量光度值。

1.3.3 細(xì)胞生化指標(biāo)的檢測(cè)

A549細(xì)胞分別暴露在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下24h，收集上清按照LDH試劑盒說明書操作，棄上清的細(xì)胞經(jīng)過裂解液裂解收集，按照CAT、SOD、總蛋白定量試劑盒進(jìn)行操作。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測(cè)

A549細(xì)胞分別暴露在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下24h，加入DCFH-DA探針，37℃孵育1h，消化離心收集細(xì)胞，進(jìn)行重懸后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)圖表分別使用GraphPad Prism和Origin8.0軟件分析。差異顯著性用2way ANOVA分析方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 GO理化性質(zhì)表征

實(shí)驗(yàn)對(duì)GO的理化性質(zhì)進(jìn)行表征，表1對(duì)GO表面的官能團(tuán)進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，GO具有非常豐富的含氧官能團(tuán)，含氧官能團(tuán)占總體的65%左右，說明其水溶性非常好，在水中能穩(wěn)定存在，能夠有很強(qiáng)的吸附性能。圖1A中透射電鏡TEM表征GO的橫向尺寸，圖1B用原子力學(xué)顯微鏡AFM表征GO外形，結(jié)果顯示，其橫向尺度分布95%在750～1 300 nm，厚度為1 nm。

表1 氧化石墨烯GO官能團(tuán)的組成及相對(duì)含量

圖1 材料氧化石墨烯GO表征A為透射電鏡圖像；B為原子力顯微鏡下GO的形態(tài)；C原子力顯微鏡分析GO的高度

2.2 GO對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

如圖 2，在0～8μg/mL濃度下A549細(xì)胞隨GO濃度升高，細(xì)胞活性升高，8μg/mLGO時(shí)A549細(xì)胞活性最好，24 h細(xì)胞活力提升26.45%，繼續(xù)增加GO濃度，細(xì)胞活性受到抑制，72 h最大抑制率為59.53%。在不同時(shí)間下，細(xì)胞活性趨勢(shì)一致。說明GO對(duì)A549細(xì)胞的作用具有雙重性，低濃度下促進(jìn)細(xì)胞活性，高濃度下抑制細(xì)胞活性。

圖2 GO不同濃度和時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)A549的活性影響

2.3 GO對(duì)A549細(xì)胞生化指標(biāo)的影響

如圖 3A，在 0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下暴露A549細(xì)胞24h，細(xì)胞總蛋白的濃度先升高后降低，在8μg/mL是，總蛋白含量最高，是空白對(duì)照的2.5倍，間接證明細(xì)胞的數(shù)量在8μg/mL最高。32μg/mL時(shí)蛋白含量為空白對(duì)照的71%，可知在此濃度下細(xì)胞的數(shù)量受到抑制，有所降低。如圖3B，在0μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL，32μg/mL的GO下暴露A549細(xì)胞24 h，處理組CAT活力顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），并隨GO濃度增大而活力降低，當(dāng)濃度達(dá)到32μg/mL時(shí)，CAT活力僅為對(duì)照組的9.45%，說明GO能顯著影響過氧化氫酶活性，從而對(duì)A549細(xì)胞活性產(chǎn)生抑制。

如圖3C，0～32μg/mL濃度下的GO，SOD活力先降低后升高，在8μg/mL時(shí)SOD活力最低，為對(duì)照組的40.5%，由于GO引起A549細(xì)胞內(nèi)活性氧升高，胞內(nèi)SOD能清除少量產(chǎn)生的活性氧，從而保護(hù)細(xì)胞，減少損傷。但隨著GO濃度在短期大量增加，胞內(nèi)活性氧大幅產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞代償應(yīng)激，A549細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)性增強(qiáng)抗氧化能力，出現(xiàn)SOD水平增高。當(dāng)32μg/mL時(shí)，SOD含量是對(duì)照組的2.06倍。如圖3D，0～32μg/mL濃度下的GO，MDA含量先降低后升高，在8μg/mL時(shí)MDA含量最低，為對(duì)照組的75.51%，說明細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化降低；隨著GO濃度升高，A549細(xì)胞內(nèi)的MDA含量顯著升高，在32μg/mL時(shí)MDA含量是對(duì)照組的1.54倍，說明A549由于氧化壓力導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

2.4 GO對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

如圖4、圖5，0～32μg/mL濃度下的GO對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量先升高后降低，在8μg/mL的GO作用時(shí)，ROS含量最低，僅為對(duì)照組的24.32%。0～32μg/mL的GO濃度下，CAT活力呈遞減趨勢(shì)，結(jié)合SOD活力分析，在0～8μg/mL濃度的GO，A549細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）與CAT、SOD活力處于一種相對(duì)平衡狀態(tài)，ROS的水平更低，細(xì)胞活力因此得到提高。在8～32μg/mL濃度的GO，A549細(xì)胞內(nèi)的CAT活力繼續(xù)降低，ROS含量與SOD活力升高，處于急性毒性刺激下的誘導(dǎo)代償升高，細(xì)胞活力受到抑制。

圖3 不同濃度GO對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)生理生化指標(biāo)影響

圖4 GO對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS影響

圖5 不同濃度GO對(duì)A549作用熒光強(qiáng)度影響

3 討論

氧化石墨烯GO憑借其獨(dú)特的理化性質(zhì)，被日益廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，必然增加更多機(jī)會(huì)暴露接觸人類，尤其是肺部。其生物安全性評(píng)估更加刻不容緩。本次實(shí)驗(yàn)選用較低濃度的GO通過體外實(shí)驗(yàn)，模擬人肺部暴露GO，選取的細(xì)胞是人肺腺癌細(xì)胞A549，來源于58歲的白人男性肺癌組織，A549具有培養(yǎng)簡單，對(duì)異物暴露刺激敏感性高，可重復(fù)性強(qiáng)，是比較理想的體外毒理學(xué)模擬肺部損傷的細(xì)胞。

通過細(xì)胞活性經(jīng)典實(shí)驗(yàn)MTT法檢測(cè)GO對(duì)A549活性的影響[5]，通過計(jì)算得出A549在不同時(shí)間點(diǎn)，不同濃度下GO暴露的存活率。結(jié)果表明，GO對(duì)A549的活性具有雙重性，低濃度下促進(jìn)細(xì)胞生長增殖，而高濃度下抑制細(xì)胞活性，其中8μg/mL的GO對(duì)A549細(xì)胞活性最高。通過對(duì)不同濃度GO處理的A549進(jìn)行裂解測(cè)蛋白含量的結(jié)果也間接證明在8μg/mL的GO下的A549細(xì)胞數(shù)量最多，并且蛋白濃度與細(xì)胞活性的趨勢(shì)一致。

研究表明納米顆粒引起的活性氧（ROS）可能是納米顆粒產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要原因之一[6]。胞內(nèi)過量的活性氧ROS是細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力增大造成的，對(duì)核苷酸產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致DNA斷裂[7]，而超氧化物歧化酶SOD和過氧化氫酶CAT是清除體內(nèi)的超氧陰離子和過氧化氫，從而減少氧化壓力，減少細(xì)胞的DNA損傷[8]。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0～32μg/mL 濃度下的 GO、CAT 活力遞減，ROS、MDA和SOD趨勢(shì)一致，都是先降低后升高。綜上，0～8μg/mL濃度的GO對(duì)A549細(xì)胞的影響其中一個(gè)主要的原因是細(xì)胞內(nèi)ROS的下調(diào)，從而降低胞內(nèi)的活性氧對(duì)細(xì)胞的毒性。

以往研究重心多集中在高濃度的GO對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物的損傷方面，還有一些研究證明GO是生物安全性方面，鮮有研究報(bào)道其對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物促進(jìn)方面，對(duì)于GO促進(jìn)A549細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚[9-10]?？赡芘cGO材料本身具有豐富的含氧官能團(tuán)，水溶性好，吸附性強(qiáng)有關(guān)，其能通過吸附代謝廢物從而降低細(xì)胞自身代謝的毒害物質(zhì)，或者材料本身具有的官能團(tuán)能與A549細(xì)胞膜表面的蛋白反應(yīng)，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)代謝，產(chǎn)生抗氧化酶，清楚胞內(nèi)自由基離子，從而保護(hù)細(xì)胞。

綜上所述，氧化石墨烯GO對(duì)A549細(xì)胞的作用具有兩重性，低濃度下降低胞內(nèi)活性氧，促進(jìn)細(xì)胞活性；高濃度下產(chǎn)生氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而其對(duì)細(xì)胞促進(jìn)方面的機(jī)制尚不清晰，需要進(jìn)一步探討研究。

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Dose effect of graphene oxide on the toxicity of human lung adenocarcinoma

MU Kui1,2,LI Deng-kun1,2,SHANG Meng-ting1,2,GE Wen-wu3,GAO Zhi-xiang1,JIANG Shuang-lin1,2*
(1.School of Biological and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China;2.Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation in Anhui，F(xiàn)uyang Anhui236037,China;3.No.1Middle School of Bozhou,Bozhou Anhui236800,China)

Oxidized graphene(GO)has the unique physical and chemical properties,such as large specific surface area,good hydrophilicity and good solution dispersion,so it is widely used in biomedicine.At present,there are few reports on the biosafety of exposed cells at low doses.GO is selected in this experiment and its physicochemical properties are characterized.The cells were incubated for 24 h in human lung adenocarcinoma cell line A549.Preparation of human lung adenocarcinoma cell A549 in vitro at a concentration of 0μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,8μg/mL,16μg/mL and 32μg/mL for 24 h,the activity of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA),catalase(CAT)and the content of intracellular protein were measured and the content of reactive oxygen species(ROS)was detected by fluorescence staining.MTT assay 24 h,48 h,72 h cell activity.The results showed that at 24 h,8μg/mL of GO exposure had the highest promoting effect on the activity of A549.Intracellular SOD and CAT activities were significantly increased,protein content increased,intracellular ROS and MDA content decreased.Con-clusion：GO has dual effects on A549 cell activity,down-regulating intracellular ROS and decreasing oxidative damage of GO onA549 cells,thus enhancing cell viability.High concentration will produce oxidative damage to cells,and inhibit cell activity.

graphene oxide;human lung adenocarcinoma cell lineA549;cell activity

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：1004-4329（2017）03-044-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）03-044-05

2017-06-02

國家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃項(xiàng)目（91643113）；安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（20528110203）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（20251000314）資助。

木 魁（1990- ），男，碩士生，研究方向：環(huán)境毒理。

姜雙林（1963- ），男，碩士，教授，研究方向：環(huán)境毒理。Email：jiangshuanglin87@163.com。