張明莉，常宏磊，馬淼

(石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003)

基于Biolog技術的外來種意大利蒼耳與本地種蒼耳根際土壤微生物功能多樣性的比較

張明莉，常宏磊，馬淼*

(石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003)

通過盆栽試驗，采用Biolog技術對比研究了外來入侵植物意大利蒼耳與本地植物蒼耳根際土壤微生物群落功能多樣性及對土壤碳源利用的差異，以未種植任何植物土壤為空白對照。結果表明，入侵植物意大利蒼耳的土壤微生物群落功能多樣性顯著高于本地植物蒼耳的土壤微生物群落功能多樣性。意大利蒼耳顯著提高了根際土壤微生物31種碳源的平均顏色變化率(AWCD)(72 h,P<0.05)，AWCD變化規(guī)律如下：意大利蒼耳>蒼耳>CK(對照)；意大利蒼耳的Shannon多樣性指數(shù)(H)、優(yōu)勢度指數(shù)(D)和豐富度指數(shù)(S)均顯著高于蒼耳和空白對照，與蒼耳相比，意大利蒼耳的H，D，S分別增加了3.13%，0.77%和21.67%，與CK相比，意大利蒼耳的H，D，S分別增加了4.59%，0.89%和35.18%，CK最低；碳代謝指紋圖譜分析表明意大利蒼耳和蒼耳的碳源利用存在顯著差異，意大利蒼耳顯著提高了根際微生物對胺類、酚酸類、氨基酸類和糖類等碳源的利用；主成分分析(PCA)表明，兩種植物根際土壤微生物碳源利用特征出現(xiàn)分異，意大利蒼耳集中在第一主成分，得分系數(shù)3.3103，蒼耳主要分布在第二主成分，得分系數(shù)-1.9616；糖類物質、羧酸類化合物、多聚物和氨基酸類是根際微生物利用的主要碳源。改變入侵地土壤微生物群落的結構與功能，提高根際土壤微生物的代謝活性，形成對自身有益的土壤微生態(tài)環(huán)境可能是意大利蒼耳成功入侵的原因之一。

生物入侵；微生物功能多樣性；意大利蒼耳；蒼耳

外來生物入侵是當今生態(tài)學的熱點問題之一，造成了入侵地生物多樣性的銳減和生態(tài)環(huán)境的嚴重破壞，對當?shù)亟洕陌l(fā)展造成了巨大的影響[1-3]。外來入侵植物不僅改變了入侵地植物多樣性的水平，而且還強烈影響了入侵地土壤生態(tài)系統(tǒng)的組成[4-5]。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，亦是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的因子，直接參與植物代謝，物質循環(huán)，氧化分解等過程，對植物的生長和競爭具有舉足輕重的作用[6-8]。植物與土壤是相互依存的，植物可以調節(jié)根際土壤微環(huán)境，而適宜的土壤環(huán)境又為植物提供了有利的生存條件[6,9-10]。入侵植物擴散到新的棲息地并形成穩(wěn)定的種群，就會通過各種途徑引起土壤生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生改變，進而為其營造更好的生存條件，反過來這種改變有利于外來植物在與本土植物的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，從而加劇外來植物的擴散[11-12]。因此，研究入侵植物對土壤微生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響，對其入侵機理的揭示有著重要的科學意義[6,9]。

意大利蒼耳(Xanthiumitalicum)是菊科蒼耳屬一年生草本植物，原產于北美和南歐[13]，20世紀90年代入侵我國。該植物于2012年在新疆被首次記錄[14]，現(xiàn)已廣泛分布于北疆的大部分地區(qū)和南疆的烏恰縣，因其適應能力強，繁殖能力高，種子擴散結構發(fā)達，個體競爭能力強，極易在入侵地形成單一優(yōu)勢種群落，種群擴張速度快，已經對當?shù)氐谋就林参锒鄻有浴⑿竽翗I(yè)及農業(yè)生產造成了嚴重的危害[15]。對入侵植物的有效防治是各國政府及科研人員面臨的一項嚴峻挑戰(zhàn)[16]，目前對意大利蒼耳的研究主要集中在外部形態(tài)特征、種群分布[17-18]、化學成分及化感作用[19]等方面，有關其對入侵地土壤微生物群落影響的研究尚未見報道。本研究在嚴格受控條件下，以未種植植物的土壤為對照，對比研究了意大利蒼耳和本地土著植物蒼耳(Xanthiumsibiricum)對根際土壤微生物功能多樣性的影響，旨在為揭示該外來植物成功入侵的機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試植物：意大利蒼耳與蒼耳的種子均于2014年9月采自石河子市郊，帶回實驗室，陰干后置于干燥室溫條件下儲存?zhèn)溆谩９┰囃寥溃壕鶠樯惩痢?/p>

1.2試驗設計

于2015年4月20日在盛有沙土的育苗盤中播種意大利蒼耳和蒼耳的種子，置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中育苗，晝夜時間為14 h/10 h，光照強度為450 μmol/(m2·s)。出苗10 d后選擇長勢一致的幼苗移栽至盛有沙土的花缽中，花缽高10 cm，直徑為9 cm，沙土厚度為8 cm，意大利蒼耳和蒼耳各20盆，每個花缽里種1株苗，以不種植任何植物的沙土為空白對照，定時等量澆水。3個月后均生長至果期，分別取意大利蒼耳和蒼耳根系周圍的土壤混勻過1 mm篩，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測定方法

土壤微生物功能多樣性的測定采用Biolog 生態(tài)板(Biolog-Eco PlateTM)的方法[20]，Biolog EcoPlate有96個微孔，每32個孔為1個重復，共3次重復，32個微孔中除對照孔內無碳源外，其他各孔都含有一種不同的有機碳源和相同含量的四唑紫染料。在一定溫度條件下，通過將微生物溶液接種至微孔內進行培養(yǎng)，微生物呼吸產生的電子發(fā)生轉移，使微孔內的染料四唑發(fā)生氧化還原反應而變色，顏色的深淺反映了微生物對相應碳源的利用能力。通過Biolog系統(tǒng)的微平板讀數(shù)器，測定Eco板在590 nm波長下的吸光值，完成數(shù)據(jù)的采集與存儲。Eco板的31種單一碳源可分為六大類：糖類(10種)、羧酸類(7種)、氨基酸類(6種)、多聚物類(4種)、多胺類(2種)和芳香化合物類(2種)[21-23]。

1.4試驗方案

稱取相當于10 g烘干土的鮮土加入裝有100 mL已滅菌的0.85%生理鹽水三角瓶中，室溫震蕩60 min，然后用0.85%的生理鹽水稀釋至1000倍，再震蕩30 min后，吸取稀釋液接種到生態(tài)板(ECO板)中，每孔加150 μL。將接種好的Biolog-Eco微平板置于25 ℃的保濕恒溫箱中培養(yǎng)，每隔12 h在Biolog EmaxTM讀數(shù)器上讀取波長為590 nm下的光密度值，持續(xù)至156 h。

1.5數(shù)據(jù)處理

用31個孔的平均顏色變化率(AWCD)表示微生物代謝的整體活性。計算Shannon物種多樣性指數(shù)(H)，Shannon均勻度指數(shù)(E)，Shannon優(yōu)勢度指數(shù)(D)，碳源利用豐富度指數(shù)(S)。

(1)微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(AWCD)用于描述土壤微生物代謝活性，計算公式如下：

AWCD=∑(Ci-Ri)/n

式中:Ci為每個孔的光密度值;Ri為對照孔的光密度值;n=31，為ECO板的孔數(shù)。

(2)Shannon指數(shù)(H)用于評估物種的豐富度，計算公式如下：

H=-∑Pi(lnPi)

式中:Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有孔中相對吸光值總和的比值，計算公式如下:

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

(3)Shannon均勻度指數(shù)(E)，計算公式如下：

E=H/logS

式中:S為顏色變化孔數(shù)。

(4)Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)用于評估某些最常見種的優(yōu)勢度，計算公式如下:

D=1-∑Pi2

(5)碳源利用豐富度指數(shù)(S)：

S=被利用碳源的總數(shù)

1.6數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對72 h的實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、碳代謝指紋圖譜分析和主成分分析(PCA)；利用Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1根際土壤微生物AWCD的比較分析

由31種碳源AWCD值的變化格局(圖1)可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，意大利蒼耳和蒼耳根際土壤微生物利用總碳源代謝強度呈逐漸增加的趨勢，0～12 h內，AWCD值均為0，12 h后，AWCD值都很小，表明碳源基本未被利用；培養(yǎng)24 h之后AWCD值快速升高，說明碳源利用率快速增加，相比而言，意大利蒼耳根際微生物碳源利用率增加速度顯著快于蒼耳根際土和空白對照。在培養(yǎng)至144 h時，AWCD值均趨于穩(wěn)定。在72 h時，蒼耳與意大利蒼耳的AWCD值均顯著高于CK(P<0.05)，較之CK分別增加了29.47%和76.84%，并且意大利蒼耳的根際土壤微生物AWCD值極顯著地高于本地植物蒼耳(P<0.01)，較蒼耳高出了36.59%。說明，意大利蒼耳和蒼耳根際土壤的微生物代謝活性顯著地高于未種植物的空白對照，且意大利蒼耳根際土壤微生物群落利用總碳源的能力極顯著地高于蒼耳，這種格局在整個培養(yǎng)期間一直存在。

圖1 土壤根際微生物群落AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化Fig.1 AWCD changes with incubation time of different treatments

2.2根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)的比較分析

如圖2所示，入侵植物意大利蒼耳根際土壤微生物的H、D、S均顯著高于本地植物蒼耳和CK(P<0.05)，與蒼耳相比，意大利蒼耳的H、D、S分別增加3.13%、0.77%和21.67%，與CK相比，意大利蒼耳的H、D、S分別增加4.59%、0.89%和35.18%，而意大利蒼耳根際土壤微生物群落的E顯著低于蒼耳和CK(P<0.05)，且蒼耳與CK的H、D、S、E無顯著差異。

圖2 根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)Fig.2 Diversity indices for rhizosphere soil microbial communities不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference at P<0.05. The same below.

2.3根際微生物碳代謝指紋圖譜的比較分析

微生物對ECO板上不同碳源的利用能力圖被定義為Biolog代謝指紋圖譜。圖3表明，與CK(對照組)相比，意大利蒼耳根際土壤微生物顯著提高了對D-半乳糖內酯、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸、α-環(huán)式糊精、肝糖、D-半乳糖醛酸、α-羥基丁酸、D-葡萄胺酸、衣康酸、D-蘋果酸、苯乙基胺、腐胺、2-羥苯甲酸以及4-羥基苯甲酸等19種碳源的利用率。

圖3 不同處理土壤根際微生物對31種碳源的利用Fig.3 Different treatment of soil rhizosphere microorganisms of 31 kinds of the use of carbon source

與本地植物蒼耳相比，意大利蒼耳顯著提高了根際土壤微生物對糖類碳源D-半乳糖內酯、D-甘露醇、α-D-乳糖、D，L-α-甘油，氨基酸類碳源L-絲氨酸，聚合物類碳源α-環(huán)式糊精、肝糖，羧酸類碳源D-葡萄胺酸、衣康酸、D-蘋果酸， 胺類碳源苯乙基胺、 腐胺和酚酸類碳源4-羥基苯甲酸等13種碳源的利用效率(P<0.05)， 其對D-甘露醇和α-D-乳糖的利用效率分別是蒼耳的1.8和8.7倍，對α-環(huán)式糊精和肝糖的利用效率分別是蒼耳的1.30和1.67倍，對D-葡萄胺酸、衣康酸和D-蘋果酸的利用效率分別是蒼耳的1.65、5.60和4.87倍，對胺類碳源苯乙基胺和腐胺的利用效率分別是蒼耳的1.55和1.20倍，對4-羥基苯甲酸的利用效率是蒼耳的1.44倍。

2.4根際土壤微生物對碳源代謝的主成分分析

通過對培養(yǎng)72 h的31種碳源底物利用情況進行主成分分析，共提取了2個主成分，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別可以解釋所有變量的72.98%和27.02%，2個主成分累積方差貢獻率達到100%，可以全面的概括31個變量的特征。由表1可知，蒼耳在PC2上的得分高，意大利蒼耳在PC1上的得分高。

因子載荷反映了主成分與碳源利用的相關程度，因子載荷絕對值越接近于1，表示該碳源對主成分的影響越大。表2顯示，與第一主成分有較高相關性的碳源有21個，分別是胺類的苯乙基胺和腐胺；聚合物類的吐溫80和α-環(huán)式糊精；氨基酸類的L-精氨酸，L-天冬酰胺酸，L-苯基丙氨酸，L-絲氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸；酚酸類化合物的2-羥苯甲酸；羧酸類化合物丙酮酸甲脂，D-半乳糖醛酸，γ-羥基丁酸，D-葡萄胺酸，衣康酸，α-丁酮酸和D-蘋果酸；糖類物質的β-甲基D-葡萄糖苷，D-甘露醇，N-乙?；?D-葡萄胺和D-纖維二糖。而與第二主成分相關性較高的碳源僅有2個，是糖類物質的D-木糖和D，L-α-甘油。

3 討論

平均顏色變化率(AWCD)表征了微生物群落的碳源利用率，是用于描述土壤微生物代謝活性的重要指標[24]，AWCD值越大，微生物群落的代謝活性就越強[25-26]。研究表明，AWCD的變化從適應期—對數(shù)期—穩(wěn)定期，代謝速率相應的從慢—快—慢，這與一般微生物的增長規(guī)律一致[27]。在為期156 h的整個培養(yǎng)階段，意大利蒼耳的AWCD值均顯著高于蒼耳和空白對照，說明意大利蒼耳根際土壤微生物的代謝活性和碳源利用率顯著地高于蒼耳和空白對照，這與趙曉紅等[28]、陳華[29]對外來植物與土壤微生物關系的研究結果基本一致。

表1 主成分得分及貢獻率Table 1 Scores and contribution rate of principal component (PCA)

表2 31種碳源的因子載荷Table 2 Factor loading of 31 carbon sources

微生物代謝的多樣性指數(shù)分析能夠準確地反映微生物群落功能多樣性的變化， Shannon多樣性指數(shù)(H、D、E)和碳源利用豐富度指數(shù)(S)是表征群落多樣性的常用指標[30]。D值越高，群落多樣性越高；H值越高，說明所含物種越豐富；E值越高，說明群落越均一；S值越高，說明可利用碳源種類越多[31]。意大利蒼耳的H、D和S均顯著地高于蒼耳和CK。說明意大利蒼耳根際土壤微生物群落的功能多樣性顯著高于蒼耳和對照，這與上述結果一致。

將ECO板上的31種碳源分為6類，即聚合物類、氨基酸類、羧酸類、糖類、胺類和酚酸類。與蒼耳相比，意大利蒼耳明顯提高了微生物對胺類和酚酸類碳源的利用，且提高了根際微生物對糖類碳源(4個)、氨基酸類碳源(1個)、多聚物類碳源(2個)和羧酸類碳源(3個)的利用。糖類、氨基酸類和羧酸類是植物根系分泌物的主要成分，糖類是微生物代謝利用最廣的碳源，羧酸類與病菌的感染密切相關，酚酸類是重要的化感物質[32]，有研究表明菊科入侵植物有分泌化感物質和聚集對自身有益微生物的能力，從而抑制周圍本土植物的生長[33]，Seema等[34]發(fā)現(xiàn)飛機草(Eupatoriumodoratum)對土壤微生物有聚集作用。

主成分分析(PCA)能較好地描述不同土壤微生物群落對碳源的利用狀況及其代謝特征[35]，用以分析不同種類植物對土壤微生物碳源的利用是否存在差異[36-37]。樣本在主成分上的得分和微生物對碳源底物的利用能力相關[38]。荷載因子表示絕對值越大，該碳源影響較大，第一主成分解釋了大部分變異，與第一主成分有較高相關性的碳源有21個，胺類2個，聚合物類2個，氨基酸類5個，酚酸類化合物1個，羧酸類化合物7個，糖類物質4個。結果表明入侵植物意大利蒼耳改變了根際微生物對碳源的利用，其中糖類物質，羧酸類化合物、氨基酸類和聚合物類是微生物利用的主要碳源。

本研究表明入侵植物意大利蒼耳和本地植物蒼耳土壤微生物群落功能多樣性存在明顯差異，且意大利蒼耳根際的土壤微生物群落功能多樣性顯著高于蒼耳。大量研究表明外來植物入侵改變了入侵地的土壤微生物群落結構[39-41]，并認為對入侵地土壤微生物群落的影響是其成功入侵的原因之一[42-43]。入侵植物之所以會改變入侵地的土壤微生物群落功能多樣性，是因為不同植物根系分泌物不同，根系分泌物的化學成分亦不同，根系周轉速率通常存在差異，因此外來植物在成功入侵后會改變根際與土壤間的物質運輸，從而影響土壤微生物的結構和功能[30]；另外，外來植物與本地植物地上部分的差異(例如凋落物數(shù)量和質量)也會影響土壤微生物[44]。此外，外來植物也會通過影響入侵地土壤的水分、pH和土壤的理化特性等間接地影響土壤微生物的多樣性[4]。

4 結論

通過對入侵植物意大利蒼耳、本地植物蒼耳和對照的土壤微生物群落功能多樣性的研究表明，意大利蒼耳顯著提高了根際土壤微生物31種碳源的平均顏色變化率(AWCD)(72 h,P<0.05)，AWCD變化規(guī)律如下：意大利蒼耳>蒼耳>CK，意大利蒼耳的AWCD值分別比蒼耳和CK的高36.59%和76.84%；意大利蒼耳的H、D、S均顯著高于蒼耳和空白對照；碳代謝指紋圖譜分析表明意大利蒼耳和蒼耳的碳源利用存在顯著差異，意大利蒼耳顯著提高了根際微生物對胺類、酚酸類、氨基酸類和糖類等碳源的利用；主成分分析(PCA)表明，兩種植物根際土壤微生物碳源利用特征出現(xiàn)分異，糖類物質、羧酸類化合物、多聚物和氨基酸類是根際微生物利用的主要碳源。意大利蒼耳改變了入侵地土壤微生物群落的結構及功能，顯著提高了根際土壤微生物的功能多樣性和對土壤碳源的利用效率，形成了有益于自身生長的土壤微生態(tài)環(huán)境，這很可能是其成功入侵并瘋狂擴散的原因之一。

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ComparisonoffunctionaldiversityofrhizospheresoilmicroorganismsbetweentheexoticplantXanthiumitalicumanditsnativepartnerXanthiumsibiricumbytheBiologmethod

ZHANG Ming-Li, CHANG Hong-Lei, MA Miao*

LifeScienceCollege，ShiheziUniversity,Shihezi832003,China

The aim of this research was to analyze differences in functional diversity and the carbon source utilization of the rhizosphere soil microbial community between the invasive plantXanthiumitalicumand its native partner,Xanthiumsibiricum. The two plants were cultivated in a put experiment and their soil microbial communities were analyzed using the Biolog technique. Soil with no plants served as the blank control (CK). The results indicated that the functional diversity of the soil microbial community was significantly higher for the invasive plantX.italicumthan for the native plantX.sibiricum. The rhizosphere soil microbes fromX.italicumsignificantly increased the average well color development (AWCD) (72 h,P<0.05) for 31 carbon sources. The treatments were ranked, from largest change in AWCD to smallest, as follows:X.italicum>X.sibiricum>CK. The values of Shannon’s diversity index (H), Simpson’s dominance index (D), and substrate richness index (S) were significantly higher forX.italicumrhizosphere soil microbes than for those ofX.sibiricumand CK. The Shannon’s indexes (H, D, S) of theX.italicumrhizosphere soil microbial community were 3.13%, 0.77%, and 21.67% higher, respectively, than those ofX.sibiricum; and 4.59%, 0.89%, and 35.18% higher, respectively, than those of CK. The lowest values of H, D, and S, were in CK. The carbon metabolic fingerprint analysis showed that carbon source utilization differed significantly betweenX.italicumsoil microbes andX.sibiricumsoil microbes. The rhizosphere soil microbes ofX.italicumshowed the highest utilization of amines, phenolic acids, amino acids, and sugars. A principal component analysis (PCA) showed that the carbon utilization features of soil microbial communities differed between the two plants. The soil microbial community ofX.italicumwas concentrated in the first principal component (score coefficient, 3.3102) and that ofX.sibiricumwas concentrated in the second principal component (score coefficient, -1.9616). Carbohydrates, carboxylic acids, polymers, and amino acids were the major carbon sources utilized by rhizosphere soil microbes. Therefore, the reasons for the successful invasion forX.italicumcould include: (1) changes in the structure and function of soil microbial communities; (2) increased metabolic activity of rhizosphere soil microbes; and (3) the formation of a soil microenvironment that benefits its own growth.

biological invasion; microbial functional diversity;Xanthiumitalicum;Xanthiumsibiricum

10.11686/cyxb2016500http//cyxb.lzu.edu.cn

張明莉, 常宏磊, 馬淼. 基于Biolog技術的外來種意大利蒼耳與本地種蒼耳根際土壤微生物功能多樣性的比較. 草業(yè)學報, 2017, 26(10): 179-187.

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2016-12-28；改回日期：2017-03-13

國家自然科學基金項目(編號：31360047)資助。

張明莉(1991-)，女，甘肅平川人，在讀碩士。E-mail：zhangmingli11@126.com

*通信作者Corresponding author. E-mail：mamiaogg@126.com