何文娟，陳 麗，舒 晴，周煥嬌，王雅媛，高 炎，陳 瑞，吳 松，唐宏圖，梁鳳霞△

(1. 湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061； 2.武漢市第九醫(yī)院，武漢 430082； 3. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430022)

【針灸研究】

“標本配穴”電針對糖尿病腎病的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達水平的影響?

何文娟1,2，陳 麗1，舒 晴1，周煥嬌1，王雅媛1，高 炎1，陳 瑞3，吳 松1，唐宏圖1，梁鳳霞1△

(1. 湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061； 2.武漢市第九醫(yī)院，武漢 430082； 3. 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430022)

目的：觀察“標本配穴”電針干預方法對糖尿病腎病大鼠模型腎功能、超微結(jié)構(gòu)的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達的影響。方法： Zucker fa/fa大鼠12只按隨機數(shù)字表法分為模型對照組及非電針刺激組、電針治療組，另選其同窩瘦鼠(Zucker+/?)4只作為空白對照組。非電針刺激組和電針治療組分別治療3周，于治療后第21天測其4組大鼠的飲水量、進食量、體質(zhì)量和空腹血糖、餐后血糖；治療3周后大鼠處死，觀察血清白蛋白、血肌酐、血尿素、血尿氮、腎臟超微結(jié)構(gòu)及SIRT1蛋白表達水平。結(jié)果：與模型對照組比較，“標本配穴”電針治療組大鼠進食量減少，體質(zhì)量降低，空腹血糖、餐后血糖降低，血肌酐、血尿素、血尿氮水平降低，腎臟超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善，SIRT1蛋白表達增多。結(jié)論：“標本配穴”電針能夠改善糖尿病腎病腎功能和超微結(jié)構(gòu)，可能與其上調(diào)腎臟SIRT1蛋白表達水平有關。

糖尿病腎??；標本配穴；電針；SIRT1；Zucker大鼠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，是終末期腎病的主要原因[1]，也是糖尿病致死致殘的最主要原因之一。

近年來研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而成為糖尿病腎病的一個新潛在治療靶點[2-3]。SIRT1可以從增加腎臟游離脂肪酸代謝、改善腎臟線粒體功能、促進腎臟細胞恢復自噬、減少腎臟細胞凋亡、抑制炎癥產(chǎn)生、減輕腎臟纖維化等方面延緩糖尿病腎病進程[4]。而在糖尿病腎病動物模型Zucker fa/fa大鼠中SIRT1表達下降[5]。因此，我們采用“標本配穴”電針刺激糖尿病腎病大鼠，觀察“標本配穴”電針對糖尿病腎病的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇7周齡雄性Zuckerfa/fa大鼠12只及其同窩瘦鼠4只(由北京維通利華實驗技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001，大鼠(動物許可證號為SYXK(鄂)2010-0057)在華中科技大學同濟醫(yī)學院SPF級動物飼養(yǎng)間飼養(yǎng)，溫度(23±2)℃，濕度50%～70%，12 h明暗交替。實驗過程遵守《實驗動物倫理與福利》相關原則和規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器

RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)；PMSF(碧云天生物技術研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所)； PVDF膜(Millipore)；SIRT1 多克隆兔抗、β-actin多克隆兔抗(美國Santa Cruz 公司，批號sc-15404、sc-9104)；蛋白Marker (美國Fermentas 公司，批號26616)。

針灸針(環(huán)球牌0.30×13 mm一次性針灸針)； HANS LH202H 型韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療科技醫(yī)療有限公司)；精密電子秤(SF- 400A，上海志榮電子科技公司)；快速血糖儀(強生(中國)投資有限公司)； ELX800 酶標儀(美國Biotek 公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)； EBA12R 低溫離心機(德國Hettich 公司)；日立H2600型透射電鏡(武漢大學醫(yī)學院電鏡實驗室)。

1.3 分組及處理方法

將12只Zuckerfa/fa大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型對照組(B組)、非電針刺激組(C組)、電針治療組(D組)各4只，另選無脂質(zhì)等代謝紊亂、無胰島素抵抗的同窩瘦鼠(Zucker +/?)4只為正常對照組(A組)。

C組和D組大鼠按“標本配穴”法，取“本”穴“關元”“足三里”和“標”穴“中脘”“豐隆”[6]?！瓣P元”向恥骨聯(lián)合部斜刺3 mm左右，“中脘”向劍突方向斜刺3 mm左右，“足三里”和“豐隆”直刺3 mm左右連接電針治療儀，接線方式為同側(cè)負極接“足三里”穴，正極接“豐隆”穴，另一組電針負極接“關元”，正極接“中脘”，其中足三里和豐隆兩穴為左右交替使用。C組不通電，D組通電，頻率2Hz，強度1mA,留針10 min。隔日針刺1次，共治療3周。A組和B組大鼠不給予電針或非電針刺激，僅與C組、D組以相同方法、相同時間段內(nèi)抓取固定。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 大鼠一般情況 在治療后第21天測量各組大鼠的飲水量、進食量和體質(zhì)量。

1.4.2 大鼠空腹血糖、餐后血糖 在治療后第21天采用尾靜脈采血的方式，對所有大鼠的空腹血糖及餐后血糖進行測量。測量空腹血糖之前，大鼠禁食不禁水12 h。

1.4.3 檢測大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸 3周治療結(jié)束后，各組大鼠給予腹腔10%水合氯醛注射麻醉(劑量為0.35 ml/ 100 g)，快速處死，心尖取血入抗凝管，送往我校附屬醫(yī)院湖北省中醫(yī)院檢測血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸。

1.4.4 大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)觀察 在冰上迅速取腎臟1 mm3大小的組織塊,用4%冷戊二醛溶液固定,送往我校合作單位武漢大學用于透射電子顯微鏡觀察。

1.4.5 大鼠腎臟SIRT1蛋白表達 用化學免疫印跡法檢測腎組織SIRT1蛋白表達水平，取綠豆粒大小的腎臟組織在碎冰中研磨，裂解組織提取總蛋白，BCA 法進行蛋白濃度定量。制膠，各樣本均上樣30 μg/孔蛋白進行SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入β-actin和SIRT1一抗于4 ℃ 下孵育1.5 h，二抗封閉，孵育1 h洗滌。加入化學發(fā)光底液PlusA液和PlusB液，暗室中用X 線片曝光、顯影、定影，置于成像儀中進行定量分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

表1顯示，在治療后第21天，各組大鼠的飲水量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白對照組比較，其他3組進食量顯著增多(P<0.01)，體質(zhì)量顯著上升(P<0.01)。與模型對照組比較，非電針刺激組的進食量顯著減少(P<0.01)，體質(zhì)量雖有所減輕但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；電針治療組進食量顯著減少(P<0.01)，體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。

2.2 各組大鼠空腹血糖、餐后血糖比較

表1顯示，在治療后第21天與空白對照組比較，其他3組的空腹血糖、餐后血糖均顯著升高(P<0.01)。與模型對照組比較，非電針刺激組餐后血糖明顯降低(P<0.05)，而空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；電針治療組大鼠空腹血糖和餐后血糖均明顯下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠飲水量、進食量、體質(zhì)量、空腹血糖、餐后血糖比較

注：與空白對照組比較：△△P<0.01；與模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01

表2 各組大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿酸、血尿氮和SIRT1蛋白灰度比值比較

注：與空白對照組比較：△P<0.05，△△P<0.01；與模型對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸比較

表2顯示，各組大鼠血清白蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白對照組比較，非電針刺激組血肌酐、血尿酸濃度明顯升高(P<0.05),血尿酸濃度顯著升高(P<0.01)；電針治療組血肌酐、血尿酸、血尿氮濃度雖然升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型對照組比較，非電針刺激組血肌酐、血尿氮濃度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血尿酸濃度明顯降低(P<0.05)；電針治療組血肌酐、血尿酸濃度明顯降低(P<0.05)，血尿酸濃度顯著降低(P<0.01)。

2.4 各組大鼠電鏡觀察結(jié)果

圖1顯示，空白對照組大鼠基底膜結(jié)構(gòu)良好，足突排列較為整齊清晰；內(nèi)皮孔清晰可見，內(nèi)皮細胞核呈細長形居中，核仁明顯；足細胞體積較大，形態(tài)不規(guī)則，排列于基底膜外側(cè)。模型對照組大鼠基底膜出現(xiàn)顯著增厚，尤其是在足細胞側(cè)出現(xiàn)駝峰狀增厚，上足突增寬；內(nèi)皮細胞體積縮??；足細胞體積腫脹，數(shù)量減少。非電針治療組基底膜出現(xiàn)較明顯增厚，足突排列不整齊，部分足突出現(xiàn)彌漫性融合甚至消失；內(nèi)皮細胞萎縮，足細胞固縮數(shù)量減少。電針治療組基底膜結(jié)構(gòu)較好，偶見增厚和上足突增寬；內(nèi)皮細胞體積縮小，內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)可見多泡小體，足細胞體積較大，形態(tài)排列均不規(guī)則。

圖1 “標本配穴”電針對糖尿病腎病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響

2.5 各組大鼠腎組織SIRT1蛋白表達比較

表2圖2顯示，與空白對照組比較，其他3組SIRT1蛋白表達均顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，非電針刺激組SIRT1蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；電針治療組SIRT1蛋白表達明顯增多(P<0.05)。

圖2 “標本配穴”電針對糖尿病腎病大鼠腎臟SIRT1蛋白表達的影響

3 討論

目前針對糖尿病腎病尚無特效治療方法，主要是通過運動、低蛋白飲食、控制血糖血壓、降脂和血管緊張素等藥物來治療[7-8]。這些方法對糖尿病腎病雖有緩解作用，但治療效果不明顯，且長期服用西藥對人體肝腎功能損傷較大。因此，更多的治療糖尿病腎病的方法需要被研究揭示?，F(xiàn)有研究已證實,針灸可以從調(diào)節(jié)糖脂代謝、降低尿蛋白排泄率、改善腎功能、增加腎臟血流灌注等方面治療糖尿病腎病[9-12]。

Zucker fa/fa大鼠是目前公認的2型糖尿病和肥胖的遺傳性大鼠模型，不僅表現(xiàn)為血脂等代謝紊亂，胰島素分泌缺失(β細胞功能受損)、胰島素利用障礙(肝臟和肌肉等組織胰島素抵抗)和糖耐量異常等特征[5]，還有腎小球、腎小管的損傷及蛋白尿、肌酐清除率下降等,一系列證據(jù)表明Zucker fa/fa大鼠中存在糖尿病腎病[13-16]。

本實驗以中醫(yī)針灸“治未病”理論為指導,提出“標本配穴”法[17]，即固護正氣腧穴為本、祛除邪氣腧穴為標，增強機體抵抗病邪能力為本，同時利導邪氣排除，注重調(diào)動機體整體潛在抗病能力為標，標本同治達到防治疾病的目的，兩者配合應用腧穴配伍方法[18]。選取關元、足三里、中脘、豐隆進行針灸治療。關元為任脈與足三陰經(jīng)交會穴，針之可以益精補氣，扶助人體先天之本；足三里為胃經(jīng)合穴和胃腑之下合穴，針之可補益氣血生化之源，固護后天之本；關元、足三里相配合，兼顧先天和后天，補益正氣；中脘穴位胃之募穴，八會穴之腑會，針之可以健脾和胃，通降腑氣；豐隆為胃經(jīng)之絡穴，具有化痰定喘、寧心安神之功；中脘、豐隆配合可調(diào)理腸胃、化痰和胃、祛除邪氣。四穴配合固護先天和后天，祛邪防微，可達以治為防、防治結(jié)合之目的。

另外有研究發(fā)現(xiàn)，電針尤其是低頻電針能夠促進β內(nèi)啡肽的釋放，增強胰島素分泌[19]，改善糖尿病，因此本研究采用低頻電針進行干預。

本實驗研究表明，“標本配穴”電針能夠減少糖尿病腎病大鼠的進食量，降低其體質(zhì)量，但對其飲水量無明顯影響；“標本配穴”電針也能夠降低糖尿病腎病大鼠的空腹血糖和餐后血糖；雖然“標本配穴”電針對糖尿病腎病大鼠的血清白蛋白無明顯影響，但能顯著降低其血肌酐、血尿酸、血尿氮的濃度。這些結(jié)果提示， “標本配穴”電針能夠改善糖尿病腎病的腎功能，而且“標本配穴”電針對糖尿病腎病大鼠腎臟的超微病理學結(jié)構(gòu)有明顯改善作用，還能顯著上調(diào)糖尿病腎病大鼠SIRT1蛋白的表達水平。

課題組前期的研究顯示，“標本配穴”電針能夠改善高脂飲食所致胰島素抵抗大鼠的胰島素敏感性，這與“標本配穴”電針提高骨骼肌SIRT1蛋白表達水平有關[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，電針能治療膝骨關節(jié)炎，其作用機制與電針提高膝骨關節(jié)軟骨的SIRT1表達相關[21]。另有研究證實，電針能改善老年癡呆癥的腦能量代謝，其作用與電針上調(diào)海馬體的SIRT1表達聯(lián)系密切[22]。我們由此推測，電針對全身多個器官的SIRT1都有作用，從而發(fā)揮電針整體調(diào)節(jié)的作用，這有待進一步的研究來證實。

綜上所述，“標本配穴”電針具有改善大鼠糖尿病腎病的作用，可能與上調(diào)腎臟SIRT1蛋白的表達水平有關。

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TheEffectsofElectro-acupunctureonDiabeticNephropathyandTheExpressionofRenalSIRT1ProteininZuckerDiabeticFattyRats

HE Wen-juan1, CHEN Li1, SHU Qing1, ZHOU Huan-jiao1, WANG Ya-yuan1, GAO Yan1, CHEN Rui3, WU Song1, TANG Hong-tu1, LIANG Feng-xia1△

(1.HubeiProvincialCollaborativeInnovationCenterofPreventiveTreatmentbyAcupunctureandMoxibustion/HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430061,China; 2.TheNinthHospitalofWuhan,Wuhan430082,China; 3.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Objective: To observe the effect of "the Combination of Biao-Ben Acupoints" electro-acupuncture(EA) on renal function，kidney ultramicrostructure， and the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy rats model. Methods:12 male Zucker fa/fa rats, were randomly divided into model control group, none EA group,EA group and 4 in each group. 4 zucker lean (ZL) rats (fa/-),their lean normoglycemic littermates, were set for control group. none EA group and EA group was treated, after 3 weeks, all rats were sacrificed and the blood,kidney were extracted for detection. Results: After treatment, Compared with model control group, the EA group’s food-intake reduced,weight lossed, fasting and postprandial blood glucose lower, the level of CREA, UA,BUN dropped,kidney ultramicro- structure improved,the expression of renal SIRT1 protein up-regulated. Conclusion："The Combination of Biao-Ben Acupoints" EA can improve renal function，kidney ultramicro -structure，up-regulate the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy; The Combination of Biao-Ben Acupoints; Electro-acupuncture; SIRT1; Zucker fa/fa Rats

R245.9+7

B

1006-3250(2017)09-1280-04

國家自然科學基金資助項目(81473787)-針刺通過調(diào)控下丘腦SIRT1/ FoxO1 治療胰島素抵抗肥胖的機制研究

何文娟(1988-)，女，湖北谷城人，醫(yī)學碩士，從事針灸作用機理研究。

梁鳳霞(1975-)，女，教授，醫(yī)學博士，博士研究生導師，從事針灸作用機理研究，Tel：18971371818，E-mail：315938821@qq.com。

2017-03-18