孫理軍，孫耀光，孫瑜嬬，張 琪，劉熙如，柏云飛

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

【實(shí)驗(yàn)研究】

基于SNAP-25表達(dá)的腎虛質(zhì)大鼠突觸可塑性實(shí)驗(yàn)研究?

孫理軍，孫耀光，孫瑜嬬，張 琪，劉熙如，柏云飛

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

目的：通過大鼠海馬突觸相關(guān)蛋白-25(SNAP-25)的表達(dá)，揭示腎虛質(zhì)致突觸可塑性降低的分子生物學(xué)機(jī)制。方法：通過“貓嚇鼠”造模法恐嚇受孕母鼠，待產(chǎn)子后繼續(xù)恐嚇仔鼠，從而建立先天不足、后天失養(yǎng)復(fù)合型腎虛質(zhì)仔鼠模型。補(bǔ)腎藥物左、右歸丸治療3個月后，Morris水迷宮檢測仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力，ELISA法測定海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)含量，免疫組化法檢測SNAP-25蛋白表達(dá)。結(jié)果：Morris水迷宮：模型組潛伏期、總路程、首次穿越目標(biāo)區(qū)時間較空白組長，左、右歸丸組較模型組改善；NE含量：模型組較空白組降低，左、右歸丸組較模型組升高；SNAP-25表達(dá)，模型組較空白組降低，左、右歸丸組較模型組上調(diào)。結(jié)論：腎虛質(zhì)仔鼠突觸可塑性能力減退與SNAP-25表達(dá)相關(guān)，補(bǔ)腎藥物左、右歸丸具有改善和提高作用。

腎虛質(zhì)；SNAP-25；突出可塑性

腎虛體質(zhì)以腎中精氣虛損、臟腑機(jī)能低下為主要特征，是臨床常見的體質(zhì)類型之一。中醫(yī)理論認(rèn)為“腎藏志”(《素問·宣明五氣》)、腎“在志為恐”(《素問·陰陽應(yīng)象大論》)、“腎虛則智不足”(《醫(yī)學(xué)新悟》)，驚恐可致腎精虧虛、學(xué)習(xí)記憶能力減退。大量研究表明[1-4]，學(xué)習(xí)記憶能力的獲取與鞏固與突觸可塑性相關(guān)。SNAP-25是突觸前膜蛋白，參與神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)與釋放、囊泡與細(xì)胞膜的融合對接，并具有選擇性剪接異構(gòu)體的能力，是構(gòu)成及改變突觸可塑性的關(guān)鍵蛋白。本實(shí)驗(yàn)選取SNAP-25作為研究目標(biāo)，從而探討腎虛質(zhì)與突觸可塑性能力降低的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級12周齡SD大鼠雄性5只，雌性10只(體質(zhì)量300～350 g)，購于西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心(生產(chǎn)許可證SCXK(陜)2014-001)，標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)食及飲水、室溫喂養(yǎng)。3月齡雄性土貓1只鮮活小鼠喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

左歸丸(河南宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z41020696)、右歸丸(河南宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z41022170)；Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；大鼠NE ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SABC免疫組化SNAP-25兔抗試劑盒、生物素化羊抗兔二抗、DBA顯色試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(均購自博士德生物)；OCT包埋劑、水合氯醛、多聚甲醛、液氮(均購自勇毅試劑公司)；電子天平、高速勻漿器(XHF-D)、酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司SpectraMax5)、冰凍切片機(jī)、顯微鏡、特質(zhì)鼠籠、貓籠等。

2 方法

2.1 分組與造模[5]

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，10只雌鼠隨機(jī)分成恐嚇組6只、正常組4只，分別與雄鼠合籠交配。成功受孕后恐嚇組孕鼠置于特質(zhì)鼠籠，每日早9∶00至晚21∶00于貓籠旁被恐嚇，同時在貓籠內(nèi)放置鮮活小鼠令其捕食，使孕鼠在旁觀望并處于恐慌狀態(tài)直至產(chǎn)子；正常組孕鼠不予恐嚇自然分娩。待2組所產(chǎn)仔鼠4周齡時，將正常組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)8只作為空白組，將恐嚇組母鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)24只分為腎虛質(zhì)組、腎虛質(zhì)左歸丸干預(yù)組(以下簡稱“左歸丸組”)、腎虛質(zhì)右歸丸干預(yù)組(以下簡稱“右歸丸組”)，每組各8只，繼對此3組仔鼠繼續(xù)進(jìn)行土貓恐嚇，持續(xù)4周。

2.2 給藥及計量

按文獻(xiàn)折算[6]，大鼠用藥量約為成人的6.25倍。左歸丸成人服生藥量18 g/d，則大鼠生藥量為1.875 g/kg/d，蒸餾水配置成1.875 g/mL混懸液備用。右歸丸成人服生藥量9 g/d，則大鼠生藥量為0.9 375 g/kg/d，蒸餾水配制成0.9 375 g/mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇同時開始灌胃，藥物組給予制備好的混懸液，空白組給予等量生理鹽水10 mL/kg/d，每日1次，每周用藥5 d停2 d，連續(xù)3個月。

2.3 水迷宮訓(xùn)練

圖1 各組仔鼠游動搜索策略統(tǒng)計結(jié)果(單位：次)

各組仔鼠8周齡時進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，歷時7 d，每日下午15∶00進(jìn)行。第1天仔鼠自由游動120 s適應(yīng)環(huán)境；第2～6天學(xué)習(xí)訓(xùn)練：仔鼠在水中尋找平臺并停留15 s；若120 s 后仍未找到平臺則引導(dǎo)登臺并停留15 s；訓(xùn)練完成后迅速將小鼠擦干放回鼠籠；每日訓(xùn)練4次，每次間隔30 min。第7天測試，檢測并記錄各組仔鼠4次游泳的平均路程(cm)、潛伏期(s)、首次穿越目標(biāo)區(qū)時間(s)。

2.4 神經(jīng)遞質(zhì)含量測定

末次給藥1 h后斷頭處死，冰上迅速剝離海馬，4 ℃生理鹽水沖洗、濾紙吸干水分，稱重后置液氮凍存。制備10%海馬組織勻漿，3000 r/min 離心5 min取上清，參照ELISA試劑說明書，酶標(biāo)儀450 nm處測定NE含量。

2.5 免疫組化檢測

末次灌胃結(jié)束后禁食12 h稱重，7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取海馬PBS沖洗5 min×5次，30%蔗糖溶液4 ℃冰箱脫水過夜PBS沖洗5 min×5次，OCT包埋、過液氮，冰凍切片(切片厚度為30 μm)室溫靜置1 h；切片置入甲醇新鮮配置0.3%雙氧水室溫封閉20 min， PBS沖洗5 min×3次；滴加5%BSA封閉液，室溫避光孵育30 min；棄液滴加稀釋的一抗4 ℃冰箱過夜，次日取出復(fù)溫后PBS沖洗5 min×5次；滴加二抗，室溫孵育2 h， PBS沖洗5 min×3次；避光滴加DAB顯色，室溫避光顯色30 min，PBS沖洗5 min×3次，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，干燥后光鏡下拍照。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化

表1顯示,潛伏期、總路程、首次穿越目標(biāo)區(qū)時間方面，腎虛質(zhì)組長于空白組和左、右歸丸組(P<0.01)；與腎虛質(zhì)組比較，左、右歸丸組潛伏期、總路程、首次穿越目標(biāo)區(qū)時間降低(P<0.01)；左、右歸丸2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組仔鼠Morris水迷宮參數(shù)比較

注：與空白組比較:△P<0.05,△△P<0.01；與腎虛質(zhì)組比較:*P<0.05,**P<0.01

圖1顯示，游動搜索策略統(tǒng)計結(jié)果顯示，腎虛質(zhì)組隨機(jī)性搜索策略遠(yuǎn)高于空白組、左歸丸組和右歸丸組，提示腎虛質(zhì)仔鼠游動時目標(biāo)性不明確，常出現(xiàn)無目的徘徊；而在目的明確、方向定位較高級的邊緣性、直線性、趨向性搜索策略中，腎虛質(zhì)組均低于其余3組。

3.2 海馬NE含量與SNAP-25表達(dá)變化

表2顯示，NE含量腎虛質(zhì)組較空白組下降(P<0.05)，左、右歸丸組較腎虛質(zhì)組升高(P<0.05)，左、右組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。分析比較各組仔鼠海馬區(qū)SNAP-25光密度值發(fā)現(xiàn)，腎虛質(zhì)組表達(dá)低于空白組和左、右歸丸組(P<0.01)，空白組略高于左、右歸丸組，但3組間比較差異不明顯(P>0.05)。

圖2顯示，光鏡下觀察，空白組仔鼠海馬錐體層神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目多，免疫組化染色深，細(xì)胞排列整齊、緊密；腎虛質(zhì)組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞染色淺，細(xì)胞排列疏松、紊亂，細(xì)胞間隙增大；左歸丸組與右歸丸組神經(jīng)元細(xì)胞較腎虛質(zhì)組數(shù)目增多，染色較深，細(xì)胞變化趨于空白組。

表2 各組仔鼠NE含量與SNAP-25表達(dá)比較

注：與空白組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與腎虛質(zhì)組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組仔鼠SNAP-25蛋白表達(dá)(免疫組化染色 ×200)

4 討論

學(xué)習(xí)和記憶過程由大腦控制完成，以神經(jīng)元間的信息傳導(dǎo)為基礎(chǔ)，以突觸的可塑性為表現(xiàn)形式。突觸的可塑性已被公認(rèn)為是構(gòu)成學(xué)習(xí)與記憶的重要神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)，而不斷地學(xué)習(xí)和記憶行為又可形成新的神經(jīng)回路，從而反向增強(qiáng)突觸的可塑性。通過對大鼠進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練，使其海馬內(nèi)突觸數(shù)量、突觸小泡數(shù)量或體積增加、突觸活性區(qū)膜面積增大等一系列形態(tài)化學(xué)變化，構(gòu)建加強(qiáng)其腦內(nèi)神經(jīng)突觸的可塑性及大腦皮層的發(fā)達(dá)度。

腎藏精、精生髓、腦由髓聚，故腦髓的生成與發(fā)育依賴于腎中精氣的充盈[7]，只有保證腦有所養(yǎng)、元神精湛，才能學(xué)習(xí)不止、記憶不怠。臨床上，學(xué)習(xí)記憶能力的減退是腎虛質(zhì)的主要表現(xiàn)，也是中醫(yī)腎藏志理論的重要體現(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)基于腎虛體質(zhì)的生理病理特點(diǎn)，結(jié)合大量實(shí)驗(yàn)研究，以中醫(yī)“腎藏志、在志為恐”為理論指導(dǎo)，從分子機(jī)制角度探究腎虛質(zhì)與突觸可塑性的相關(guān)性。

SNAP-25(Synaptosomal-associated protein 25 kDa)作為突觸相關(guān)蛋白，參與組成神經(jīng)突觸囊泡，與樹突、軸突、突觸小體的發(fā)育密切相關(guān)[9-11]。同時，SNAP-25還可通過提高突觸小泡蛋白與突觸融合蛋白間的親和力，增強(qiáng)突觸末梢神經(jīng)遞質(zhì)的釋放能力[12-15]，從而進(jìn)一步加強(qiáng)突觸的可塑性，提高學(xué)習(xí)記憶能力。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE對學(xué)習(xí)記憶具有維持作用，能增強(qiáng)腦內(nèi)突觸的傳入，從而促進(jìn)信息的存儲和再現(xiàn)，因此腦內(nèi)NE含量的變化可直觀反映出學(xué)習(xí)記憶物質(zhì)基礎(chǔ)的改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Morris水迷宮訓(xùn)練中，腎虛質(zhì)大鼠潛伏期、總路程、首次穿越目標(biāo)區(qū)時間較其他各組延長滯后，較其他各組游動緩慢，常出現(xiàn)無目的的徘徊游動，甚者120 s內(nèi)無法完成登錄水中平臺任務(wù)；游動搜索策略統(tǒng)計結(jié)果顯示，腎虛質(zhì)組更傾向采用隨機(jī)性搜索，而空白組及左、右歸丸組則較多采用目的明確、方向定位較高級的直線型、邊緣性、趨向性搜索策略。同時，腎虛質(zhì)組腦NE含量較正常組降低，腦海馬SNAP-25含量亦顯著低于其他各組。通過補(bǔ)腎藥物左、右歸丸干預(yù)治療后，腎虛質(zhì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯上調(diào)，腦內(nèi)NE含量與SNAP-25表達(dá)均有所增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，腎虛質(zhì)造成突觸可塑性表達(dá)降低的分子機(jī)制與腦內(nèi)SNAP-25的含量變化密切相關(guān)；補(bǔ)腎藥物具有改善和提高的作用，且2種補(bǔ)腎藥物效果平齊，均對腎虛體質(zhì)具有正面調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步說明腎虛質(zhì)主要表現(xiàn)為腎精虛的生理狀態(tài)。

此次實(shí)驗(yàn)證明，先天不足、后天失養(yǎng)的復(fù)合型腎虛質(zhì)模型符合中醫(yī)情志致病的病因?qū)W原理和中醫(yī)腎藏象理論，具有操作的可行性，同時為腎虛體質(zhì)差異性的生物學(xué)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，且為臨床干預(yù)亞健康狀態(tài)的形成以及臨床治療記憶行為能力障礙性疾病，尤其是老年性疾病的發(fā)生提供了科學(xué)有效的理論依據(jù)。

[1] NAKAZAWA KQUIRK MC,CHITWOOD RA,et al.Requirement for hippocampal CA3 NMDA receptors in associative memory recall[J].Science,2002,297(23):211-218.

[2] TANG YP,SHIMIZU E, DUBE GR,et al.Genetic enhancement of learning and memory in mice[J].Nature,1999,401(21):63-69.

[3] SHIMIZU E,TANG YP,RAMPON C ,et al.NMDA receptor-dependent synaptic reinforcement as a crucial process for memory consolidation[J].science,2000,290(12)：1170-1174.

[4] 孫瑜嬬,孫耀光,張琪,等.復(fù)合型腎虛質(zhì)大鼠神經(jīng)行為障礙與NMDA 受體表達(dá)研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2015,22(9):52-55.

[5] 孫理軍,李翠娟,王震,等.腎虛質(zhì)實(shí)驗(yàn)動物模型的構(gòu)建方法與評價[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(1):247-249.

[6] 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000:332-335.

[7] 孫理軍,孫耀光,張琪,等.腎虛質(zhì)大鼠生長發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力與與腎藏志理論的相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(1):36-38.

[8] 王愛梅,耿若君,李弋,等.旱蓮草對老年癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2016,22(3):332-335.

[9] GROSSE G,GROSSE J,TAPP R,et al.Bergmann M.SNAP-25 requirement for dendritic growth of hippocampal neurans[J].Neurosci Res，1999,156(5):539-546.

[10] OSEN-SAND A,et al.Inhibition of Axonal Growth by SNAP-25 Antisense 0Iigonucleotides in Vitro and in Vivo[J].Nature,1993 July,364(29):445-448.

[11] NAGAO M,KATO S,ODA M,HIRAI S.Expression of Phosphotyrosine and SNAP-25 immunoreactivity in grumose (foamy) spheroid bodies suggests axonal regeneration[J].Acta Neuropathol (Berl),1998,96(4):388-394.

[12] CHEN YA,SCALES SJ,PATEL SM,et al.SNARE complex formation is triggered by Ca2+and drives membrane fusion[J].Cell,1999 Apr 16,97(2):165-174.

[13] ELLEGRINI LL,O’CONNOR V,LOTTSPEICH F, et al.Clostridial neurotoxins compormise the stability of a Iow energy SNARE complex mediating NSF activation of synaptic vesicle fusion[J].EMBO J,1995 Oet 2,14(19):4705-4713.

[14] OTTO H,HANSON PI,CHAPMAN ER,et al.Poisoning by botulinum neurotoxin A does not inhibit formation or disassembly of the synaptosomal fusion complex[J].Biochem Biophys Res Commun,1995 Jul 26,212(3):945-952.

[15] LOW P,NORLIN T,RISINGER C,et al.Inhibition of neurotransmitter release in the lampery reticulospinal synapse by antibody-mediated disruption of SNAP-25 function[J].Eur J Cell Biol,1999 Nov,78(11):787-793.

ExperimentalStudyonSynapticPlasticityinRatswithKidneyDeficiencyBasedonSNAP-25expression

SUN Li-jun, SUN Yao-guang, SUN Yu-ru, ZHANG Qi, LIU Xi-ru, BAI Yun-fei

(ShaanxiUniversityofTCM,Shaani,Xianyang712046,China)

Object: Through the experimental study about expression of hippocampal synapse associatec protein-25 of rats with kidney-deficiency constitution, to discuss the molecular biology mechanism of decreased synaptic plasticity due to kidney-deficiency constitution. Method: Used the way of “cat scare rat” to scare pregnat rats. After they gave birth to a child, their offsprings got on being scared to built composite ratesl with deficiency and acquired dystrophy. Then kidney reinforcing drugs gave treatment for 3 months, Morris water maze tested offsprings’ study and learning capacity and immunohistochemical method tested their expression of SNAP-25.Results: Morris water maze test: The incubation period, total distance and the first time through target area of model group were longer than blank group, while in ZuoGui pill and YouGui pill groups, these indexes were better than model group;The change of neurotransmitter NE content: Compared with the blank group, the NE content in model group was reduced. Compared with the model group, the NE content in ZuoGui pill and YouGui pill group was increased;Expression of SNAP-25: The expression in model group decreased than blank group; but compared with model group, it increased when kidney reinforcing drugs was given.Conclusion: The decreased synaptic plasticity is related with the expression of SNAP-25, and it can be improved by the kidney reinforcing drugs.

Kidney-deficiency constitution; SNAP-25; Synaptic plasticity

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1217-03

陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究項(xiàng)目(15JS026)-基于腎藏志理論的腎虛體質(zhì)大鼠海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶蛋白Caveolin-1表達(dá)的研究

孫理軍(1961-)，女，陜西咸陽人，教授，醫(yī)學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)體質(zhì)理論的實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用研究。

2017-03-19