楊麗君+崔紅

[摘要] 目的 探討大鼠缺血低氧腦損傷對于神經元和髓鞘的影響情況。 方法 將3日齡SD新生大鼠隨機分為對照組和缺血低氧處理組，對照組不予任何特殊處理，缺血低氧處理組大鼠行左頸總動脈結扎術后休息1～2 h入封閉容器，充以8%O2+92%N2的混合氣體，處理時間為120 min，之后恢復正常氧供。待造模完成后3 d時進行尼氏小體染色探討兩組大鼠神經元的情況，造模后7 d進行勞克堅牢藍染色探討兩組大鼠的髓鞘情況。 結果 尼氏染色結果提示，與對照組相比，缺血低氧處理之后大鼠腦組織中的神經元尼氏小體染色密度明顯降低；勞克堅牢藍染色結果顯示，與對照組相比，缺血低氧處理組的髓鞘明顯受損。 結論 大鼠缺血低氧性腦損傷對腦組織的神經元和髓鞘造成了一定程度的影響，進而導致腦組織相關的功能損傷。

[關鍵詞] 腦損傷；缺血；低氧；神經元；髓鞘

[中圖分類號] R741 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0030-03

Effects of hypoxic-ischemic brain damage on neurons and myelin in immature neonatal rats

YANG Lijun CUI Hong

Department of Pediatrics， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of ischemia and hypoxic brain injury on neurons and myelin in rats. Methods Three-day-old SD neonatal rats were randomly divided into two groups including control group and ischemia-hypoxia treatment group. The control group wasnt given any special treatment. Rats in the ischemia and hypoxia treatment group were put into the closed container after left common carotid artery ligation operation and resting 1-2 hours， and the container was filled with 8%O2+92%N2 mixed gas， with the treatment time of 120 minutes， afterwards returning to normal oxygen supply. The neurons in the two groups were examined by Nedinite staining at 3 days after the completion of the modeling. The myelin sheathes of the two groups were explored by Luxol Fast Blue staining at 7 days after the compeletion of the modeling. Results The results of Nissl staining showed that， compared with that of the control group， the density of neonatal body staining was significantly decreased in the brain tissue of rats after ischemia and hypoxia treatment. Luxol Fast Blue staining results showed that the myelin sheath of the ischemic hypoxia treatment group was significantly impaired， compared with that of the control group. Conclusion Hypoxic-ischemic brain damage in rats has a certain effect on the neurons and myelin sheath of brain tissue， leading to brain tissue-related functional damage.

[Key words] Brain injury； Ischemia； Hypoxia； Neurons； Myelin sheath

缺氧缺血性腦損傷（hypoxia ischemia brain damage，HIBD）是圍產期引起早產兒和正常足月兒大腦損傷和長期神經系統后遺癥的最重要因素[1]，研究發(fā)現HIBD是導致新生兒死亡的重要原因，也是引起腦癱等嚴重后遺癥的重要原因[2]。有證據表明，在發(fā)達國家HIBD的發(fā)生率為1‰～8‰，不發(fā)達國家發(fā)病率甚至高達26‰[3，4]。造成HIBD的原因很多，如出生時產程延長、胎兒臍帶繞頸等均有罹患HIBD的更高風險[5]，此外，早產是造成新生兒HIBD的另外一個重要的危險因素[6，7]。由于早產兒結構的不成熟，對于缺氧缺血的損傷反應更為劇烈，主要表現為腦室周圍白質軟化（periventricular leukomalacia，PVL）[8-10]。早期研究發(fā)現早產兒HIBD最主要的病理改變是腦白質損傷[11]，但近年來的研究者認為，早產兒HIBD從本質上來說是一種全腦的損傷[12]，亦即缺氧缺血除了影響神經膠質細胞之外，對神經元也造成相當嚴重的影響。endprint

本研究采用3日齡SD大鼠為在體實驗的研究對象，用實驗動物模擬建立人類的早產兒HIBD模型，在不同時間點探討缺血低氧對腦組織神經元和髓鞘的影響，進一步探討腦神經受缺血低氧影響的機制，為日后進行早產兒缺氧缺血腦損傷的合理、有效的治療提供一定的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級別3日齡的SD大鼠（體重8～10 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2012-0001]。自制封閉容器，8%O2+92%N2的混合氣體由首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院統一提供。

1.2 缺血低氧模型的建立

將SPF級3日齡的SD大鼠（共20只）隨機分為對照組和缺血低氧處理組，對照組不予任何處理，缺血低氧處理組首先進行缺血模型的建立，4%水合氯醛按照10 μL/10 g的量對大鼠乳鼠進行麻醉，固定在手術木板上之后，取左鎖骨上位置進行開口，開口0.8～1 cm左右，小心探查，尋找左頸總動脈，用玻璃分針小心分離動脈，穿入2根6-0的手術線，分別結扎，兩個結扎點之間離斷動脈，然后縫合，回母鼠身邊休息1～2 h，之后入自制封閉容器，充以8%O2+92%N2的混合氣體（37℃水?。?，時間為120 min，之后回母鼠身邊休息。

1.3 尼氏小體染色步驟

焦油紫（甲酚紫，cresyl violet，CV）染色液的配制方法：溶液A：取冰醋酸4.6 mL，加水至400 mL，溶液B：取2.72 g無水乙酸鈉，加水至100 mL，將328 mL 溶液 A與72 mL 溶液 B混合后調pH至4.0（用冰乙酸），上述溶液中加入0.4 g焦油紫，充分進行混勻，靜置一周后待用。具體染色步驟如下：冰凍切片從冰箱中取出后充分晾干，入70%酒精中4 h進行脫脂，之后入蒸餾水洗數分鐘，0.1%焦油紫醋酸水溶液染色5 min，最后入100%酒精1 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.4 勞克堅牢藍（luxol fast blue，LFB）染色步驟

取對照組和HI組冰凍切片脫水至100%酒精，入LFB染液中37℃過夜（16～24 h），冷卻至室溫，在95%酒精浸泡3～5 min洗去多余染液，用蒸餾水洗3 min，之后入0.05%碳酸鋰分色10 s，再次用蒸餾水洗3 min，入70%酒精分色，最后用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

2 結果

2.1 缺血低氧模型成功建立

課題組前期進行了大量的缺血低氧性腦損傷相關的工作，能夠熟練建立相關的動物模型，動物模型的存活率幾乎可以達到100%。造模后常規(guī)行HE染色，確認模型建立成功與否。

2.2 尼氏小體染色

使用自配的焦油紫染色液按照染色步驟進行腦組織神經元尼氏小體的染色，結果提示，缺血低氧3 d后，神經元尼氏小體數量明顯減少，且與對照組相比，尼氏小體分布不均勻，顏色變淺，深淺不一，透明度也變得不一致。見封三圖4。

2.3 勞克堅牢藍染色

LFB染色結果提示，缺血低氧發(fā)生7 d后，胼胝體區(qū)以及側腦室周邊區(qū)域的髓鞘藍染降低，與對照組染色的鮮艷藍色不同，缺血低氧處理組的染色偏紅，提示缺血低氧7 d后，脫髓鞘現象非常嚴重。見封三圖5。

3 討論

缺氧缺血腦損傷是臨床常見胎兒/新生兒腦損傷，主要原因在于局部或完全腦缺氧、血流量減少或暫停，有較高的死亡率和致殘率，引起HIBD原因很多，其中早產是造成HIBD的重要因素之一，早產兒HIBD表現較足月兒更為嚴重，隨著圍產醫(yī)學的快速發(fā)展，早產兒存活率也隨之上升，近年來早產兒的結局也有了很大的改善，但早產兒由于腦損傷而帶來的后遺癥仍是不可忽略的社會問題。HIBD的發(fā)病機制非常復雜，目前仍尚未完全闡明，有研究者認為HIBD損傷的主要細胞為少突膠質細胞[13-16]，認為少突膠質細胞祖細胞是HIBD的易損細胞，但后來一些研究發(fā)現[17-19]HIBD是一種全腦損傷，HIBD發(fā)生時除了累及神經膠質細胞，神經元也受到嚴重損傷，本研究對此進行了探討，結果發(fā)現在缺血低氧的刺激下，尼氏小體數量明顯降低。研究認為[20]尼氏小體是由許多規(guī)則而成平行排列的粗面內質網和其間的游離蛋白體以及多核蛋白體組成的聚合體，為神經元合成蛋白質的主要場所，分布于神經元胞漿的嗜堿性顆粒。尼氏小體的功能與神經元的功能存在密切的關系，軸突蛋白質大多來自神經元胞體的尼氏小體，神經元在其興奮傳導過程中，需要不斷消耗某些蛋白質物質，尼氏小體可提供新的蛋白質以補充這種消耗[21]。正常情況下，尼氏小體在神經元中的數量和分布具有特定性，但病理情況下，神經元變性時，尼氏小體的變化非常敏感，逐漸由正常的塊狀或顆粒狀變成粉末狀甚至消失，本研究發(fā)現缺血低氧3 d后，與對照組相比，神經元尼氏小體數量明顯減低，尼氏小體分布不均勻，顏色變淺，深淺不一，透明度也變得不一致。

造模7 d時間點的勞克堅牢藍染色結果顯示，缺血低氧刺激下，即損傷發(fā)生后7 d腦組織胼胝體區(qū)域（corpus callosum，cc）和側腦室（lateral ventricle，LV）周邊髓鞘藍染率仍下降明顯，提示缺血低氧導致的髓鞘損傷和脫髓鞘情況較嚴重。既往研究發(fā)現，HIBD發(fā)生時，少突膠質細胞的祖細胞對于缺氧缺血的刺激較為敏感，在此過程中易于受到嚴重影響，繼而導致髓鞘受損嚴重[22-24]，本研究也證明了這一點。

綜上，研究發(fā)現在缺血低氧腦損傷發(fā)生時，尼氏小體受到嚴重的影響，髓鞘也由于缺血低氧的刺激導致大量脫失，因此，如何增加缺血低氧后腦組織神經元尼氏小體的存活、維持髓鞘的數量以及進行髓鞘再生的治療也許是未來對早產兒HIBD治療的另一個可能的潛在方向。

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