蔣朱秀 蔡宛如 李敏靜 陳 曄 江 勁 鄭小偉 蔡月琴

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清中Gc球蛋白和內(nèi)毒素的影響*

蔣朱秀1蔡宛如1李敏靜1陳 曄1江 勁1鄭小偉2蔡月琴2

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

膿毒癥 急性肺損傷 加味大承氣湯 Gc球蛋白 內(nèi)毒素 大鼠

膿毒癥多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克和大手術(shù)后，是臨床上危重病中最常見的死亡原因[1]。中西醫(yī)結(jié)合治療膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷在臨床有一定的療效，但其機(jī)制不甚明確，本研究通過加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠的Gc球蛋白和內(nèi)毒素的影響進(jìn)行探討，從而闡明加味大承氣湯治療膿毒癥急性肺損傷的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為200～220g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-2016，動(dòng)物合格證號(hào)：2008001665123，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組、地塞米松組、中西醫(yī)結(jié)合組，每組8只。

1.2 主要試劑：ELISA法測(cè)定Gc球蛋白試劑盒，批號(hào)：E20161227703和ET試劑盒，批號(hào)：E20161227704，均購(gòu)于杭誠(chéng)維生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物：加味大承氣湯由大黃、芒硝各10g，厚樸、枳實(shí)、麥冬、當(dāng)歸各12g，生黃芪20g組成。藥物均購(gòu)自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥房，自動(dòng)煎藥機(jī)煎出藥液，再濃縮為含生藥10g/ml。醋酸地塞米松片：浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)1505121。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.4.1 膿毒癥急性肺損傷模型的制備：動(dòng)物購(gòu)來后飼養(yǎng)7天，實(shí)驗(yàn)前禁食過夜，自由飲水。預(yù)留正常組后，其余均進(jìn)行造模處理，以5%氯胺酮（0.2ml/100g體重）肌肉麻醉后固定、腹部脫毛、消毒、鋪無菌洞巾。沿腹正中線作1.5cm切口，找到盲腸，仔細(xì)剝離腸系膜，在盲腸根部結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管。用5ml塑料注射器針頭穿刺盲腸3次，擠出少許腸內(nèi)容物。之后，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢。立即動(dòng)物皮下注射生理鹽水10ml抗休克。

1.4.2 動(dòng)物分組和給藥：動(dòng)物無干預(yù)飼養(yǎng)后隨機(jī)分為正常組、急性肺損傷模型組（模型組）、加味大承氣湯（中藥組）、地塞米松組、中藥+地塞米松（中西醫(yī)結(jié)合組），每組8只。造模后立即灌胃給藥1次，以及造模后8h灌胃1次，各組給藥治療方案：加味大承氣湯組分別以10ml/kg的劑量灌胃2次；地塞米松組分別以5mg/kg的劑量灌胃2次；中西醫(yī)結(jié)合組2種藥物同時(shí)灌胃，模型組和正常組以劑量10ml/kg的生理鹽水灌胃。各組大鼠于造模結(jié)束后處死，收集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集與處理：各組大鼠麻醉后，分別留取左肺用10%甲醛固定備用，留取右肺迅速置入－80℃冰箱中凍存。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)與觀察：分述如下。

1.6.1 病理學(xué)觀察：左側(cè)肺組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木精伊紅(HE)染色，鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.6.2 血清Gc球蛋白和內(nèi)毒素的檢測(cè)：各組大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清，－20℃貯存?zhèn)溆茫瑧?yīng)用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)Gc球蛋白和內(nèi)毒素的濃度。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察：正常組大鼠飲食毛發(fā)正常，活動(dòng)靈敏，呼吸均勻平穩(wěn)，大便正常；模型組大鼠部分死亡，精神萎靡，皮毛無光澤，呼吸頻率加快，口鼻周圍有分泌物，不思飲食；藥物干預(yù)治療組大鼠死亡率低，大鼠的活動(dòng)性、反應(yīng)性以及進(jìn)食飲水狀況明顯優(yōu)于模型組，其中中西結(jié)合治療組大鼠存活情況最好，其進(jìn)食、活動(dòng)情況和反應(yīng)性最佳。

2.2 各組大鼠腹腔和肺臟肉眼形態(tài)學(xué)觀察：正常組大鼠腹腔中無明顯滲液，各臟器供血良好，肺臟外觀色澤粉紅，無明顯異常；模型組大鼠腹腔中可見大量混濁滲液，胃腸組織脹氣充血，肺組織充血水腫脹大，呈黯紅色。而中藥組、地塞米松組和中西醫(yī)結(jié)合湯組則腹腔滲液和肺組織水腫明顯輕于模型組。2.3 加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠模型支氣管和肺組織形態(tài)學(xué)的影響：取左肺組織切片HE染色后Olympus顯微鏡觀察并照相，見圖1。正常組：肺組織基本正常，肺泡間隔無明顯增寬，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無明顯腫脹，無出血和纖維素滲出。模型組：肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)明顯水腫，伴有大量紅細(xì)胞滲出和纖維素沉積，肺泡間隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可見高度腫脹。地塞米松組：較模型組肺泡間隔有所變窄，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕，出血明顯減少，纖維素滲出相對(duì)減少。加味大承氣湯處理組：較模型組肺泡間隔亦有所變窄，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕，出血減少，纖維素滲出明顯減少。中西醫(yī)結(jié)合組：較模型組肺泡間隔變窄，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯減輕，出血明顯減輕，纖維素滲出明顯減少，恢復(fù)程度最佳。

圖1 各組大鼠支氣管和肺組織形態(tài)比較

2.4 加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清Gc球蛋白和內(nèi)毒素的影響：見表1。

3 討論

膿毒癥是指感染引起的全身炎癥反應(yīng)，其發(fā)生和發(fā)展本是一個(gè)極其復(fù)雜且迅速的病理生理過程，Gc球蛋白通過部分去糖化，改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能，轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞激活因子（MAF），增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，參與損傷的免疫應(yīng)答。Gc球蛋白可作為膿毒癥發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要觀察指標(biāo)，反映機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外肌動(dòng)蛋白清除儲(chǔ)備能力、細(xì)菌內(nèi)毒素清除能力，有學(xué)者認(rèn)為Gc球蛋白可以作為一個(gè)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白來判斷急性或嚴(yán)重?fù)p傷性疾病的預(yù)后[2]。

表1 各組大鼠血清Gc球蛋白和ET比較（±s）

表1 各組大鼠血清Gc球蛋白和ET比較（±s）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別正常組模型組中藥組地塞米松組中西醫(yī)結(jié)合組Gc球蛋白（mg/ml）236.41±6.35 163.82±9.29△△210.41±5.68**221.09±4.85**230.62±9.15**內(nèi)毒素（EU/mL）0.32±0.08 0.62±0.05△△0.48±0.07**0.42±0.05**0.36±0.06**

膿毒癥急性肺損傷是臨床危重疾病，隨著感染的發(fā)生，胃腸道黏膜屏障受損，菌群紊亂，內(nèi)毒素入血，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。而加味大承氣湯由大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝、生黃芪、麥冬、當(dāng)歸組成，奏通腑瀉熱、清營(yíng)活血之功。臨床研究表明大承氣湯具有降低腸腔壓力、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，能夠清除腸細(xì)菌和腐敗物，避免腸功能衰竭所導(dǎo)致的細(xì)菌移位，減少全身性感染疾病的發(fā)生的作用[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺與大腸相表里，若肺氣被邪毒所遏，肺失宣肅，則可見喘促吸數(shù)，邪毒傳入陽(yáng)明與腸道糟粕縛結(jié)，肺氣不通則濁氣不降，擾亂了肺與大腸相表里的生理狀態(tài)而出現(xiàn)喘促癥，這與膿毒癥急性肺損傷大鼠模型中的癥象一致。而加味大承氣湯方全方具有瀉下熱結(jié)，蕩滌積滯，暢通腑氣作用。本研究結(jié)果顯示，加味大承氣湯具有抗炎作用，膿毒癥急性肺損傷模型中，內(nèi)毒素水平上升，Gc球蛋白下降明顯，而加味大承氣湯可在一定程度上改善膿毒癥急性肺損傷的肺泡炎癥，我們認(rèn)為加味大承氣湯可能通過上調(diào)Gc球蛋白水平從而降低內(nèi)毒素水平，減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)，其具體的機(jī)制和作用靶點(diǎn)有必要進(jìn)行深入研究。

[1]Sykes E,Cosgrove JF.Acute renal failure and the critically ill surgical patient[J].Ann R Col lSurg Engl,2007,89(1)：22-29.

[2]Almansa R,Wain J,Tamayo E,et al.Immunological monitoring to prevent and treat sepsis［J］.Crit Care,2013,17（1）：109-111.

[3]趙伯賢.大承氣湯對(duì)重癥急性胰腺炎患者血清 IL-6、TNF-α和 CRP的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2016,51（10）：713-714.

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠免疫系統(tǒng)以及PCT、Gc-globul in調(diào)控作用的研究，編號(hào)：2015ZA103

2017-05-31