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(1.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 211171;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)室,江蘇南京 210023)

不同發(fā)酵天數(shù)的芝芪菌質(zhì)對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

阮鳴1,喻斌2,霍光明1,張李陽(yáng)1,周紅霞1

(1.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 211171;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)室,江蘇南京 210023)

為篩選較佳的芝芪菌質(zhì)發(fā)酵時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn),雞紅細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn),小鼠血清溶血素、IgM和IgG的含量檢測(cè),以及小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),考察了不同發(fā)酵天數(shù)的芝芪菌質(zhì)對(duì)免疫抑制小鼠非特異性和特異性免疫功能的影響。結(jié)果表明:發(fā)酵25、30 d的芝芪菌質(zhì)具有顯著的免疫增強(qiáng)功效(p<0.05,0.01;0.05),提示可有效增強(qiáng)免疫功能低下人群的機(jī)體免疫力。

赤芝,黃芪藥渣,雙向性固體發(fā)酵,小鼠,免疫功能

目前國(guó)內(nèi)有多家藥廠(chǎng)生產(chǎn)黃芪精口服液,每年約有500噸黃芪藥渣作為廢棄物待處理。中藥渣如不能有效處理,會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染,同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的二次污染[1]。黃芪藥渣已被證實(shí)是有效的固體發(fā)酵基質(zhì),除了含有大量粗纖維外,還含有較多的中藥有效活性成分和粗蛋白、粗脂肪、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素,仍具有較高的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,可通過(guò)雙向性固體發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行再開(kāi)發(fā)利用[2]。

芝芪菌質(zhì)是將靈芝菌種接種于黃芪藥渣中進(jìn)行固體發(fā)酵得到的靈芝菌絲體與黃芪藥渣的發(fā)酵復(fù)合體。一方面培養(yǎng)基中黃芪藥渣的化學(xué)成分為靈芝真菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),另一方面靈芝真菌的酶又可改變黃芪藥渣的組織和成分,故具有雙向性,亦稱(chēng)為雙向性固體發(fā)酵技術(shù)[3]。在雙向性固體發(fā)酵工藝中,發(fā)酵天數(shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的成分及活性有重要影響[4-5]。靈芝和黃芪均為藥食兼用型藥材,并被大量研究證實(shí)可顯著增加機(jī)體免疫功能[6-11]。課題組前期研究已證實(shí)芝芪菌質(zhì)對(duì)雞、魚(yú)、蝦具有顯著的免疫促進(jìn)作用,且免疫活性強(qiáng)于靈芝菌、黃芪藥渣及兩者發(fā)酵前的物理混合物[12-14]。

本文通過(guò)非特異性免疫和特異性免疫多項(xiàng)免疫指標(biāo)篩選較佳發(fā)酵天數(shù)的芝芪菌質(zhì),為其增強(qiáng)人體抵抗力的功能性食品及藥品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

KM雄性小鼠384只(18～22 g)、SD雄性大鼠8只(180～220 g) 上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;芝芪菌質(zhì) 南京曉莊學(xué)院藥用菌物研究所制備;靈芝菌 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(菌種編號(hào):5.0616);黃芪藥渣 江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司(批號(hào):15102825);匹多莫德片 賽諾菲(批號(hào):140811);印度墨汁 Solarbio LIFE SCIENCES(No.1221F021);Na2CO3、甲醇、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、NaH2PO4、Na2HPO4國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;0.9～1.1 mm玻璃熔點(diǎn)毛細(xì)管 上海曼賢實(shí)驗(yàn)儀器商行;瑞氏染液、20%綿羊紅細(xì)胞懸液、RPMI-1640 培養(yǎng)基和臺(tái)盼藍(lán) 南京建成生物技術(shù)研究所;刀豆素A(Con A) 美國(guó)AMRESCO公司(批號(hào):20151217);小鼠IgGELISA試劑盒、小鼠IgM ELISA試劑盒 欣博盛生物科技有限公司(Lot.M160809-116b,Lot.M160914-129a)。

SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州蘇凈公司;101A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 常州市范軍干燥設(shè)備有限公司;LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);SynergyH1型酶標(biāo)儀 美國(guó)BIOTEK公司;IX71型熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司;MCO-5AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同發(fā)酵天數(shù)芝芪菌質(zhì)的制備 將黃芪藥渣置于60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干,粉碎,過(guò)20目篩,混勻,調(diào)節(jié)含水量至55%,裝于發(fā)酵瓶中,物料體積占發(fā)酵瓶容器體積的1/2,120 ℃高壓滅菌120 min,備用。取固體培養(yǎng)基干重量10%～15%的靈芝菌種接種于黃芪藥渣發(fā)酵基質(zhì)中,于25 ℃恒溫發(fā)酵室培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)人員每天觀察兩次,待菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)瓶時(shí)記為0 d,數(shù)天后終止發(fā)酵。收集整瓶發(fā)酵產(chǎn)物冷凍干燥,得芝芪菌質(zhì)。按不同發(fā)酵天數(shù)芝芪菌質(zhì)取樣G0、G5、G10、G15、G20、G25、G30(G0代表菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)全瓶后0 d,G5代表菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)全瓶后5 d,依次類(lèi)推),粉碎,過(guò)200目篩,加0.1% CMC-Na配成芝芪菌質(zhì)含量為20 g/L混懸液。

1.2.2 小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)分組方法 取KM雄性小鼠120只(18～22 g),隨機(jī)分成10組,每組12 只:對(duì)照組(正常組)、模型(環(huán)磷酰胺)組、陽(yáng)性(匹多莫德,0.32 g/kg)組、給藥組7組(G0、G5、G10、G15、G20、G25、G30)。除對(duì)照組外,其它各組均采用環(huán)磷酰胺復(fù)制免疫抑制小鼠模型。

造模方法:實(shí)驗(yàn)第1～3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg),1次/d,連續(xù)3 d。第6 d再以相同劑量強(qiáng)化一次。

給藥方法:第1 d開(kāi)始灌胃給藥,0.2 mL/10 g/d給藥,400 mg/kg,1次/d,連續(xù)給藥7 d,第6 d晚禁食12 h后,第7 d上午最后1次給藥,進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)方法:每只鼠尾靜脈注射5倍稀釋的印度墨汁0.05 mL/10 g體重,分別于第2、12 min用毛細(xì)采血管在小鼠眼眶后靜脈叢取血20 μL溶于2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,搖勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白,于600 nm處測(cè)定吸光度。

檢測(cè)指標(biāo):取小鼠肝、脾臟,稱(chēng)重。計(jì)算廓清指數(shù)K、校正廓清指數(shù)α。

K=(log OD1-log OD2)/(t2-t1)

α=K1/2×體重/(肝重+脾重)

注:OD1和OD2分別是第2、12 min的吸光度,t1和t2分別為2、12 min。

1.2.3 雞紅細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn) 分組、造模、給藥方法同1.2.2。

檢測(cè)方法:最后一次給藥后1 h,每只小鼠腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液1 mL。間隔30 min頸椎脫臼處死,將其仰位固定于鼠板上,正中剪開(kāi)腹壁皮膚,經(jīng)腹腔注入生理鹽水1 mL,轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。然后吸出腹腔液0.5 mL,平均分滴于2片玻片上,自然干燥,以甲醇溶液固定,加入瑞氏染液染色1 min,滴加pH6.5的PBS與染液混勻,靜置5 min,純凈水沖去染料,干燥后鏡下觀察計(jì)數(shù),計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)[15]。

檢測(cè)指標(biāo):吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100;

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞

1.2.4 對(duì)免疫抑制小鼠血清溶血素的影響 分組、造模、給藥方法同1.2.2。

檢測(cè)方法:給藥7 d后,每鼠腹腔注射20%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液0.2 mL致敏,給藥14 d后眼眶取血制備血清,用于溶血素的檢測(cè)。將收集好的血清做系列稀釋,確定最佳稀釋度。吸取稀釋的血清0.5 mL放入另一試管中,依次加入20% SRBC、10稀釋補(bǔ)體、0.9%生理鹽水各0.5 mL,空白管用生理鹽水代替血清,混勻,置37 ℃溫箱溫1 h,然后置冰浴中5 min以終止反應(yīng),離心,取上清液于540 nm 處測(cè)定OD值,計(jì)算出溶血素含量。

檢測(cè)指標(biāo):溶血素含量=樣本血清的OD值×稀釋倍數(shù)。

1.2.5 對(duì)免疫抑制小鼠血清IgM、IgG含量影響 分組、造模、給藥方法同1.2.2。檢測(cè)方法:采用ELISA法,按照說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定血清中IgG、IgM含量。

1.2.6 對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 含藥血清的制備:實(shí)驗(yàn)各組SD雄性大鼠連續(xù)灌胃給藥(400 mg/kg)7 d后,頸動(dòng)脈取血,制備含藥血清。對(duì)照組和ConA組共用1只空白大鼠、其他給藥7組分別用1只大鼠制備含藥血清。

脾細(xì)胞原代培養(yǎng):小鼠用75%乙醇浸泡5 min,無(wú)菌操作取脾臟,用完全RPMI-1640培養(yǎng)基制備2.0×106/mL的脾細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染料檢測(cè)細(xì)胞活力>95%以上,備用。

表1 碳粒廓清和雞紅細(xì)胞吞噬功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The experimental results from carbon clearance and phagocytosis of chicken red blood cells(±s,n=10)

注:*p<0.05;**p<0.01。

表2 小鼠血清溶血素和IgM、IgG的含量檢測(cè)Table 2 Determination of hemolysin,IgM and IgG in mice serum(±s,n=10)

注:*p<0.05;**p<0.01。實(shí)驗(yàn)方法:將各組100 μL脾細(xì)胞懸液分別加入96孔培養(yǎng)板中,再分別加入Con A(終濃度為5 μg/mL)及含藥血清,總體積200 μL。設(shè)置只加200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

每實(shí)驗(yàn)組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。加液后把培養(yǎng)板置于微量振蕩器上振蕩2 min混勻,于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中溫育72 h,變色后用MTT法于酶標(biāo)儀測(cè)吸光值A(chǔ)(λ=490 nm)。增殖指數(shù)SI=樣品組A/ConA組A。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表1可見(jiàn),對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)與模型組相比p<0.05,0.01,表明造模成功,即除對(duì)照組外其余各組都是免疫功能低下的小鼠。陽(yáng)性組各檢測(cè)指標(biāo)與模型組相比p<0.05,0.01,表明匹多莫德片可有效提高免疫功能低下小鼠的機(jī)體免疫力。G25、G30兩組芝芪菌質(zhì)均可顯著增加免疫抑制小鼠K值、α值、雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率(與模型組比較,p<0.05,0.01;0.05),提示發(fā)酵25、30 d的芝芪菌質(zhì)可顯著提高免疫抑制小鼠的非特異免疫吞噬功能。但發(fā)酵5～20 d的芝芪菌質(zhì)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)卻未見(jiàn)顯著增強(qiáng)(與模型組比較,p>0.05)。

2.2特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)

由表2可以看出,對(duì)照組各檢測(cè)指標(biāo)與模型組相比p<0.01,表明造模成功。陽(yáng)性組各檢測(cè)指標(biāo)與模型組相比p<0.05,0.01,表明陽(yáng)性藥有效(同表1)。G25、G30組均可顯著增加免疫抑制小鼠血清中IgM和IgG含量(與模型組比較,p<0.05,0.01;0.05),其中G25組還可有效提高免疫抑制小鼠血清中溶血素水平(與模型組比較,p<0.05),提示發(fā)酵25、30 d的芝芪菌質(zhì)均可顯著提高免疫抑制小鼠的特異性體液免疫功能。

表3所列結(jié)果表明,對(duì)照組吸光值與ConA組相比,ConA可顯著增加小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(p<0.01)。G25、G30組的吸光值均顯著增加(與模型組比較,p<0.05),提示發(fā)酵25、30 d的芝芪菌質(zhì)可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖,可顯著提高免疫抑制小鼠的特異性細(xì)胞免疫功能。

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 3 The results from mouse spleenlymphocyte proliferation experiment(±s)

注:*p<0.05;**p<0.01。

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,發(fā)酵25、30 d的芝芪菌質(zhì)均具有顯著的特異性和非特異性免疫促進(jìn)功效,說(shuō)明在發(fā)酵初期,靈芝菌在不斷吸收黃芪藥渣中的營(yíng)養(yǎng)成分、處于生長(zhǎng)階段,黃芪藥渣中的有效成分也因酶的作用在變化,因此未體現(xiàn)出明顯的免疫功效;當(dāng)發(fā)酵天數(shù)達(dá)到25 d時(shí),芝芪菌質(zhì)基本達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài),免疫增強(qiáng)活性也達(dá)到了最強(qiáng);當(dāng)發(fā)酵天數(shù)繼續(xù)增加時(shí),芝芪菌質(zhì)的化學(xué)成分和免疫增強(qiáng)功能又發(fā)生了變化,因此發(fā)酵天數(shù)為30 d的芝芪菌質(zhì)雖然具有免疫增強(qiáng)活性,但與發(fā)酵25 d的芝芪菌質(zhì)相比(p<0.01),部分指標(biāo)顯著性略有不同(p<0.05)或無(wú)顯著性(p>0.05);如果繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,芝芪菌質(zhì)會(huì)因水分的缺失而干枯,故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最長(zhǎng)發(fā)酵天數(shù)為30 d。

本課題組前期研究結(jié)果表明:黃芪藥渣與靈芝菌經(jīng)雙向性固體發(fā)酵25 d后,黃芪藥渣中的有效成分黃芪甲苷轉(zhuǎn)變?yōu)楫慄S芪甲苷[16]。有學(xué)者證明在PHA刺激下,異黃芪甲苷和黃芪甲苷均能顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2活性,活性指數(shù)分別為 80.19%和66.10%,而對(duì)照組僅為51.11%;在LPS刺激下,異黃芪甲苷誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1B和IL-8能力強(qiáng)于黃芪甲苷[17]。IL-2是一種由T細(xì)胞激活的細(xì)胞因子,具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用;IL-1B可激活T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,并有抗菌活性;IL-8也是一種常見(jiàn)的中性粒細(xì)胞趨化性細(xì)胞因子,可提高炎癥應(yīng)答。此外,在Con A誘導(dǎo)下,1 μg/mL異黃芪甲苷可明顯刺激脾細(xì)胞增殖[18]。這些藥效學(xué)研究結(jié)果均為黃芪藥渣發(fā)酵后具有增效作用提供依據(jù)。本課題組前期還研究發(fā)現(xiàn),芝芪菌質(zhì)中多糖、蛋白質(zhì)的含量在第25 d達(dá)發(fā)酵高峰,總皂苷含量在第20 d達(dá)發(fā)酵高峰[4]。已有的動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)20～25 d發(fā)酵的芝芪菌質(zhì)能明顯增強(qiáng)AA肉雞對(duì)新城疫、禽流感H9、H5的免疫力[19]。而其他學(xué)者將靈芝接種于雷公藤上,觀察不同發(fā)酵時(shí)間所得菌質(zhì)的化學(xué)成分、急性毒性和免疫功能的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第30 d(G30)所得的菌質(zhì)總二萜的含量最低,為0.57%;與雷公藤生藥比較,G30的LD50最高,甚至G30所得菌質(zhì)的體液免疫和細(xì)胞免疫抑制作用亦是最強(qiáng)[5]。以上研究結(jié)果表明不同發(fā)酵天數(shù)芝芪菌質(zhì)中化學(xué)成分與動(dòng)物免疫功能密切相關(guān)。

綜上所述:雙向性固體發(fā)酵往往伴隨著化學(xué)成分的改變,故可實(shí)現(xiàn)增效、擴(kuò)效等作用。但固體發(fā)酵產(chǎn)物的成分、藥效與發(fā)酵時(shí)間密切相關(guān),發(fā)酵時(shí)間的不同可引起芝芪菌質(zhì)中某些效應(yīng)成分含量的差異,后者又會(huì)導(dǎo)致芝芪菌質(zhì)免疫促進(jìn)活性的不同。本文通過(guò)免疫活性實(shí)驗(yàn)確定了較佳發(fā)酵天數(shù)的芝芪菌質(zhì),筆者隨后將水提該菌質(zhì)得其水提液,再經(jīng)大孔樹(shù)脂分離得到不同濃度的乙醇洗脫部位,并經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定免疫活性部位,最后在免疫活性部位中分離制備有效成分或有效成分群。

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Effectsofzhiqifungalsubstancefromdifferentfermentationtimeonimmunefunctionofimmunodeficiencymice

RUANMing1,YUBin2,HUOGuang-ming1,ZHANGLi-yang1,ZHOUHong-xia1

(1.Jiangsu Provincial Key Construction Laboratory of Special Biomass Waste Resource Utilization,School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation ofChinese Materia Medica,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

To screen the optimal fermentation time of Zhiqi fungal substance,effects of zhiqi fungal substance from different fermentation days on specific and nonspecific immune function of immunodeficiency mice were investigated by experiments of mouse carbon clearance,phagocytosis of chicken red blood cells,determination of hemolysin,IgM and IgG in mice serum,mouse spleen lymphocyte proliferation. The results indicated that zhiqi fungal substances after 25 and 30 days’ fermentation had both distinct immune-enhancing-effect(p<0.05,0.01;0.05),which hinted they could obviously strengthen immunocompromised population’s immunity.

Ganodermalucidum;Radixastragaliresidue;bidirectional solid fermentation;mouse;immune function

TS201.4

A

1002-0306(2017)19-0289-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.053

2017-03-24

阮鳴(1979-)，女，博士，講師，研究方向：藥食兼用食品的功能性研究及其化學(xué)成分的分析，E-mail：1169195814@qq.com。

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20150088，BK20151564)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573713)；江蘇省高校重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(蘇教高[2016]8)。