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(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

乳酸乳球菌LLY003的安全性評價

蘇振博,許云賀*,張莉力

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

乳酸乳球菌LLY003是分離于老北京酸豆汁中的優(yōu)勢乳酸菌,具有生長周期短,高效產(chǎn)酸,黏附綠豆淀粉使其快速沉降的能力,可用于工業(yè)生產(chǎn)乳酸菌飲料和綠豆淀粉絮凝劑。本實驗主要評價該株乳酸菌的安全性,為生產(chǎn)應用提供安全保障。通過動物實驗,有害代謝產(chǎn)物實驗,耐藥性實驗以及其他評價實驗,確定該株菌為食用安全菌。結(jié)果表明,小鼠在進行動物實驗期間無死亡、一切生命活動正常且主要臟器無病變;有害代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果均為陰性;常見的8種抗生素中對鏈霉素、萬古霉素和諾氟沙星表現(xiàn)為抗性且均不含質(zhì)粒;不會產(chǎn)生溶血和易位現(xiàn)象。通過對該株菌的安全性評價可知乳酸乳球菌LLY003是安全的,為新型乳酸菌的生產(chǎn)應用奠定基礎。

乳酸乳球菌LLY003，動物實驗,有害代謝產(chǎn)物,耐藥性,安全性

老北京豆汁,是北京地區(qū)獨具特色的傳統(tǒng)風味小吃。是以新鮮的綠豆為原料,將綠豆中淀粉過濾出制作粉條等食品后,用剩余的殘渣進行發(fā)酵生產(chǎn)出來具有養(yǎng)胃、解毒、清火等功效的優(yōu)質(zhì)飲品,是綠豆殘渣再次利用的點睛之作[1-3]。傳統(tǒng)的乳酸菌比如保加利亞乳桿菌等,有很多年的食用歷史其安全性較好[4],但在進行應用的過程中培養(yǎng)條件比較苛刻,所以造成市場中主要以酸奶和發(fā)酵乳飲料為主,產(chǎn)品種類較為單一[5]。乳酸乳球菌LLY003來源于植物發(fā)酵產(chǎn)品,是老北京酸豆汁中的優(yōu)勢菌株,屬于新型研發(fā)乳酸菌。雖然來源于自然發(fā)酵的食物源,但在純菌濃度較高的條件下進行發(fā)酵應用的安全性尚未了解,并且乳酸菌應用的過程中已經(jīng)出現(xiàn)安全性問題[6-7],所以對該菌的安全性評價尤為重要。

本實驗通過動物實驗,有害代謝產(chǎn)物實驗,耐藥性實驗以及其他評價實驗,將具有生長周期短(24 h活菌數(shù)能達到9.3×1011CFU/mL),高效產(chǎn)酸(24 h后pH下降到3.5左右),黏附綠豆淀粉使其快速沉降作用的自創(chuàng)植物源乳酸菌進行安全性評價。確定該株菌為食用安全菌株,為新型乳酸菌的生產(chǎn)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

乳酸乳球菌LLY003、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌 錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院食品微生物實驗室;健康KMSPF雄性小鼠 體重16～18 g左右,來源于錦州醫(yī)科大學SPF級動物培養(yǎng)中心;綠豆汁液體培養(yǎng)基[8-9]用來培養(yǎng)乳酸乳球菌LLY003、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、精氨酸,酪氨酸,賴氨酸,組氨酸和鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基配制方法見文獻[10-12];哥倫比亞血瓊脂平板購買自無錫賽維商務有限公司;氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、對二甲氨基苯甲醛、95%乙醇、濃鹽酸、乙醚、硝酸鉀、可溶性淀粉、碘化鉀、溴甲粉紫、液體石蠟 天津市風船化學試劑科技有限公司;蛋白胨、乳糖、酵母膏、瓊脂糖 北京奧博星生物技術有限公司;L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-鳥氨酸 sigma公司;Tris base、溶菌酶、硼酸、Na2EDTA·2H20、溴化乙錠、1kb DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒 沈陽天根生化試劑責任有限公司;藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司提供。

立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;DYY-4C型電泳儀電源 北京市六一儀器廠;雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;凝膠成像分析系統(tǒng) 金壇市盛藍儀器制造有限公司;SCAN300型全自動菌落計數(shù)器 Interscience。

1.2實驗方法

1.2.1 動物實驗

1.2.1.1 適應性喂養(yǎng) 將24只體重為16～18 g左右的健康雄性KM小鼠隨機分成6組,每組4只,用于進行動物實驗。設置環(huán)境溫度22 ℃,濕度60%,光照12 h,鼠糧和純凈水每天補足,喂養(yǎng)3 d后進行實驗[13]。

1.2.1.2 急性毒性實驗 隨機選取適應性喂養(yǎng)后的2組小鼠進行分組,分成實驗組和對照組。調(diào)整活化后菌液濃度至2.0×1010CFU/0.2 mL無菌生理鹽水,每天一次定時定量灌胃,劑量為0.2 mL/只,空白對照組灌胃無菌生理鹽水[14]。喂養(yǎng)期間保證小鼠自由進食、進水,記錄觀察小鼠死亡狀況、體重等一般生理狀態(tài)[15-17]。解剖前一天禁食、禁水,第8 d采用頸椎脫臼法處死解剖后,觀察心、肝、脾、肺、腎變化并稱其質(zhì)量,計算臟器指數(shù)=m1/m2。(式中:m1:臟器質(zhì)量g,m2:小鼠體重質(zhì)量g)

1.2.1.3 30 d喂養(yǎng)實驗 隨機選取適應性喂養(yǎng)后的2組小鼠進行分組,分成實驗組和對照組。根據(jù)實驗1.2.1.2急性毒性實驗操作過程,延長喂養(yǎng)時間至30 d。第31 d處死解剖后,觀察心、肝、脾、肺、腎變化并稱取其質(zhì)量,計算臟器指數(shù)。

1.2.2 有害代謝產(chǎn)物評價實驗

1.2.2.1 硝酸鹽還原酶檢測實驗 將活化后的菌懸液按照8%接種量(v/v)接入到滅菌后的硝酸鹽培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h后先滴加5%的KI溶液10滴,再滴加5%的淀粉溶液10滴,充分振蕩混勻的培養(yǎng)基,最后觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時制作的空白對照組[18]。

1.2.2.2 氨基酸脫羧酶檢測實驗 將活化后的菌懸液按照8%接種量(v/v)分別接入到滅菌后的五種氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)24 h和48 h,觀察培養(yǎng)基顏色變化。同時制作對照組[19]。

1.2.2.3 吲哚實驗 將活化后的菌懸液按照8%接種量(v/v)分別接入到滅菌后的蛋白胨水培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h。取出后向培養(yǎng)基中加入2 mL乙醚并充分振蕩,然后靜止片刻,在乙醚層中滴加10滴吲哚試劑,觀察乙醚層顏色變化。同時制作對照組[19]。

1.2.3 耐藥性評價實驗

1.2.3.1 藥敏實驗 采用K-B(藥敏紙片瓊脂擴散法)進行藥敏實驗[18],取無菌生理鹽水稀釋后濃度為1.0×109CFU/mL的菌懸液0.1 mL,均勻涂布于綠豆汁固體培養(yǎng)基表面,放置30 min以上待干燥后,將紙片平貼在涂好細菌的瓊脂表面。所用的藥敏紙片分別為:紅霉素、鏈霉素、卡那霉素、萬古霉素、青霉素、諾氟沙星、阿奇霉素和四環(huán)素[20-21]。貼好藥物紙片的平板放置30 min以上,然后倒置平板30 ℃培養(yǎng)48 h,用游標卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈大小。(同時設計金黃色葡萄球菌作為質(zhì)控菌株進行陽性對照)

1.2.3.2 質(zhì)粒提取實驗 取2 mL活化后的菌懸液,使用質(zhì)粒提取試劑盒和溶菌酶,按照操作過程提取乳酸乳球菌LLY003的質(zhì)粒。然后利用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒別[22],利用圖像記錄分析系統(tǒng),在254 nm紫外燈照射下,觀察是否有電泳條帶。

1.2.4 其他評價

1.2.4.1 溶血實驗 在無菌條件下,用滅菌的接種環(huán)挑取活化后的菌懸液劃線于血瓊脂平板中,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h后,觀察菌落周圍是否有明顯的溶血圈,拍照記錄溶血反應現(xiàn)象[23]。(用金黃色葡萄球菌作為陽性對照組進行比較)

1.2.4.2 細菌易位實驗 隨機選取適應性喂養(yǎng)后的2組小鼠進行分組,分成實驗組和對照組。根據(jù)1.2.1.2急性毒性實驗操作過程,延長喂養(yǎng)時間至30 d。第31 d無菌條件下解剖處死后,并用滅菌的手術刀將心、肝、脾、肺、腎取出,用無菌生理鹽水制備濃度為10%的臟器研磨液,進行平板菌落計數(shù)涂布,30 ℃下倒置培養(yǎng)48 h,觀察平板上有無菌落生長[18]。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0軟件中的t檢驗,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異顯著性分析。數(shù)據(jù)的表示方式為平均值±標準差(x±SD;n=4)。

2 結(jié)果與討論

2.1動物實驗

本實驗,選取7 d(急性毒性實驗)和30 d(亞慢性毒性實驗)對實驗小鼠進行處理。小鼠經(jīng)過灌胃7 d處理,小鼠無死亡,飲食、飲水正常,精神狀態(tài)、皮膚狀態(tài)正常,排泄物無異常且小鼠體重變化隨培養(yǎng)天數(shù)增多呈現(xiàn)正相關趨勢,且實驗組小鼠體重與對照組小鼠體重差異不顯著(p>0.05)(見表1)。第8 d解剖后,小鼠的心、肝、脾、肺、腎無組織病變,且通過臟器指數(shù)比較實驗組和對照組差異不顯著(p>0.05)(見表2)。小鼠經(jīng)30 d灌胃處理,在第31 d解剖后,實驗結(jié)果及現(xiàn)象同急性毒性實驗。(見表3、表4)。通過臟器指數(shù)的比較,可以較明顯的比對出該株菌對小鼠的主要臟器沒有毒副作用。所以,本實驗通過7 d急性毒性實驗和30 d喂養(yǎng)實驗對乳酸乳球菌LLY003的動物實驗指標進行安全性評價,結(jié)果說明急性毒性和亞慢性毒性結(jié)果是安全的。

表1 動物體重(g)變化Table 1 The weight(g)change of animals

注:同行肩標小寫字母相同者表示差異不顯著(p>0.05)；表2～表4同。

表3 動物體重(g)變化Table 3 The weight(g)change of animals

表2 急性毒性實驗臟器指數(shù)結(jié)果Table 2 The index results of acute toxicity organ

表4 30 d喂養(yǎng)實驗臟器指數(shù)結(jié)果Table 4 The index results of 30 d feeding experiment

2.2有害代謝產(chǎn)物實驗

2.2.1 硝酸鹽還原酶檢測實驗 乳酸乳球菌LLY003的硝酸鹽還原酶實驗結(jié)果培養(yǎng)基渾濁且為黃色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應,乳酸乳球菌LLY003不產(chǎn)生硝酸鹽還原酶。有些細菌在增殖過程中會產(chǎn)生硝酸鹽還原酶,具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[18]。硝酸鹽類物質(zhì)是食品中常見的物質(zhì),亞硝酸鹽更是一種劇毒物質(zhì)和強致癌物,是食物中毒的主要物質(zhì);若乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物中有硝酸鹽還原酶,攝入后在人體內(nèi)造成危害。

2.2.2 氨基酸脫羧酶檢測實驗 乳酸乳球菌LLY003氨基脫羧酶活性檢測實驗結(jié)果培養(yǎng)基渾濁且為黃色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應,乳酸乳球菌LLY003不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶。有些具有氨基酸脫羧酶的細菌,能將食物中的氨基酸發(fā)生脫羧反應生成生物胺類物質(zhì),使培養(yǎng)基變成堿性[18]。比如毒性較強的組氨酸變成組胺或酪氨酸變成酪胺。作為食品中三大營養(yǎng)物質(zhì)之一的蛋白質(zhì)(基本組成單位為氨基酸)是食品中最常見的基本營養(yǎng)物質(zhì),游離氨基酸在食品中的存在也是相當普遍,所以氨基酸脫羧酶的檢測是非常重要的。攝入過量的生物胺可引起頭痛、惡心、呼吸困難、高血壓等中毒癥狀,還會對神經(jīng)系統(tǒng)造成重大傷害,是重要的食品安全問題。

2.2.3 吲哚實驗 乳酸乳球菌LLY003的實驗培養(yǎng)基渾濁且乙醚層為無色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應,乳酸乳球菌LLY003不產(chǎn)生色氨酸酶。細菌含有色氨酸酶,在增殖過程中會生成色氨酸酶,該酶能夠分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))[18,27]。色氨酸酶一旦分解人體內(nèi)的色氨酸,就會造成人體中的色氨酸代謝異常,導致嚴重疾病發(fā)生。

2.3耐藥性評價實驗

隨著抗生素在臨床治療的廣泛應用,乳酸菌的耐藥性也越來越嚴重,長期攝入耐藥性的乳酸菌會給臨床治療帶來很大的困難,所以乳酸菌的耐藥性問題成為了研究人員的研究熱點[28]。但是對于乳酸菌耐藥性的出現(xiàn)并不全是問題,乳酸菌為了較好的適應環(huán)境變化而產(chǎn)生的自身耐藥性是安全合理的。但是有些乳酸菌可能主動或被動地通過質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)座子將耐藥基因轉(zhuǎn)移到宿主基因組中,經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等基因表達過程后發(fā)生耐藥性表達,就會產(chǎn)生危害[29-30]。耐藥性實驗結(jié)果見表5,常見的8種抗生素中對紅霉素、阿奇霉素、四環(huán)素和卡那霉素表現(xiàn)為安全的低敏,其他均為抗性且均不含質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果見圖1,乳酸乳球菌LLY003的3個樣品平行泳道上面均沒有條帶出現(xiàn),說明乳酸乳球菌LLY003沒有質(zhì)粒存在,耐藥基因不能轉(zhuǎn)移到人基因組上進行表達,食用較安全。

表5 耐藥性實驗檢測結(jié)果Table 5 The results of resistance test

圖1 質(zhì)粒提取電泳圖Fig.1 Electrophoregram of plasmid extraction注:M:1kb DNA Marker;1、2、3:乳酸乳球菌LLY003。

注:抑菌圈直徑:≥15高度敏感(H);10-14中度敏感(I);<10不敏感(L);0為抗性(R)。2.4其他評價實驗

2.4.1 溶血實驗 有些細菌在增殖代謝過程中會產(chǎn)生一種能與血液中的紅血球發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì),這種物質(zhì)就是溶血素。在補體的作用下,抗原(紅血球)和抗體(溶血素)進行溶解反應,將抗體溶解,進而引發(fā)破壞紅血球,造成集體嚴重的溶血反應,導致貧血等一系列反應出現(xiàn)[31-32]。溶血實驗結(jié)果見圖2,乳酸乳球菌LLY003在血平板上培養(yǎng)48 h后長出乳白色菌落且沒有溶血圈,屬于沒有毒性的γ-溶血(金黃色葡萄球菌為陽性對照β-溶血組)。

圖2 溶血實驗檢測結(jié)果Fig.2 The results of hemolysis test注:A為實驗組乳酸乳球菌LLY003、B為陽性對照組金黃色葡萄球菌。

2.4.2 細菌易位實驗 細菌易位現(xiàn)象是腸道微生態(tài)系統(tǒng)中存在的一種不正常易位現(xiàn)象。正常情況下,機體除了胃腸之外的主要器官組織不允許檢測出細菌,一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就會存在潛在危害。可以發(fā)生細菌易位的細菌在正常的腸道微生態(tài)系統(tǒng)中是沒有的,假如攝入的外援菌具有穿越腸道黏膜的功能,就會發(fā)生細菌易位現(xiàn)象,增加重大疾病發(fā)生的危險系數(shù)[33]。細菌易位實驗結(jié)果見表6,培養(yǎng)31 d的健康小鼠在無菌操作下解剖制成10%勻漿涂布于綠豆汁固體培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)48 h后沒有出現(xiàn)菌落生長的現(xiàn)象,說明乳酸乳球菌LLY003沒有發(fā)生細菌易位現(xiàn)象,是較安全的食用乳酸菌菌株。

表6 細菌易位實驗檢測結(jié)果Table 6 The results of bacterial translocation test

3 結(jié)論

通過對乳酸乳球菌LLY003的安全性評價可知,小鼠在進行動物實驗期間無死亡、一切生命活動正常且主要臟器無病變,臟器指數(shù)與對照組差異不顯著(p>0.05),沒有急性毒性和亞慢性毒性現(xiàn)象出現(xiàn);有害代謝產(chǎn)物檢測結(jié)果均為陰性;常見的8種抗生素中對鏈霉素、萬古霉素和諾氟沙星表現(xiàn)為抗性且均不含質(zhì)粒;不會產(chǎn)生溶血和易位現(xiàn)象。所以,乳酸乳球菌LLY003是安全的。

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SafeassessmentofLactococcuslactisLLY003

SUZhen-bo,XUYun-he*，ZHANGLi-li

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

LactococcuslactisLLY003 was an advantage of lactic acid bacteria isolated from the old Beijing acid bean juice,with a short growth cycle,efficient acid,adhesion of green bean starch to the ability to quickly settle.It could be used for industrial production of lactic acid bacteria drinks and mung bean starch flocculant.This experiment mainly evaluated the safety of the lactic acid bacteria and provided the security for the production and application.Through the animal experiments,harmful metabolite experiments,drug resistance experiments and other evaluation experiments determined the strains of bacteria as edible safety bacteria.The results showed that mice did not die during the animal experiments and all life activities were normal and the major organs were free of disease.The hazardous metabolites were negative.The common eight antibiotics were resistant to streptomycin,vancomycin and norfloxacin and were free of plasmids. Did not produce hemolysis and translocation.The results showed thatLactococcuslactisLLY003 was safe and laid the foundation for the production and application of new lactic acid bacteria.

LactococcuslactisLLY003；animals experiments；harmful metabolite；drug resistance;security

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0105-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.020

2017-03-24

蘇振博(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:18741650809@163.com。

*通訊作者:許云賀(1978-)，男，博士，副教授，主要從事畜牧微生物應用研究，E-mail:sn_97@126.com。

國家自然科學基金項目(31301499);遼寧省自然科學基金項目(2014022046);遼寧省自然科學基金項目(2014022052)。