羅婷婷，馬云桐，裴瑾，鄒玉霞，周碧乾，鐘芙蓉

·品種品質(zhì)·

黃連種子后熟過程中抗氧化酶活性動態(tài)變化的研究

羅婷婷，馬云桐，裴瑾，鄒玉霞，周碧乾，鐘芙蓉

目的：探討黃連種子在后熟過程中抗氧化酶活性的動態(tài)變化。方法：分別以4 ± 1 ℃（低溫）和18 ± 1 ℃（常溫）進(jìn)行層積處理黃連種子，測定黃連種子的抗氧化酶活性。結(jié)果：黃連種子后熟過程中，過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA) 含量總體呈上升趨勢。低溫處理種子中過氧化物酶(POD)含量顯著高于常溫處理，其余抗氧化酶活性無顯著差異。結(jié)論：黃連種子通過各抗氧化活性酶相互作用，在種子后熟過程中有效地消除活性氧對細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響，并促進(jìn)黃連種子的形態(tài)和生理后熟，從而保證種子順利萌發(fā)。

黃連種子；后熟；抗氧化酶；動態(tài)變化

種子在層積處理過程中受到周圍環(huán)境中氧氣、水分等的影響。種子體內(nèi)產(chǎn)生的O2-(或HO2-)、OH?及其活性衍生物等自由基活性氧，包括H2O2，ROOH等，它們攻擊膜體系中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致過氧化過程，并產(chǎn)生最終產(chǎn)物丙二醛[1]。二者均能嚴(yán)重的損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致種子失活。但種子同時存在膜保護(hù)系統(tǒng)，能夠清除體內(nèi)多余的自由基，其活性氧自由基代謝是一個動態(tài)的變化過程，這一保護(hù)酶系統(tǒng)實際上是一個抗氧化系統(tǒng)[2]，它是由許多酶和還原型物質(zhì)組成，其中過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是主要的抗氧化酶，可清除體內(nèi)有害的活性氧，則有利于清除種子內(nèi)因脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生的毒害，保護(hù)植物膜系統(tǒng)，同時有研究表明種子內(nèi)部存在的抗氧化防御系統(tǒng)，可加速儲藏物質(zhì)的分解，為新細(xì)胞原生質(zhì)的構(gòu)成提供能量[3]。因此，它們的活性高低與種子活力高低密切相關(guān)，直接關(guān)系到種子是否能完成后熟。

野生黃連分布于湖北、湖南、四川、重慶、甘肅、貴州省海拔1200-1700m的山谷密林之中，由于過度采挖，資源瀕臨滅絕，大多人工栽培，由于黃連種子體積小，對生長環(huán)境要求嚴(yán)格，自身要經(jīng)過9個月左右的形態(tài)后熟和生理后熟過程才能萌發(fā)等特點[5-6]。本實驗通過測定黃連種子在后熟過程中抗氧化酶活性的變化，研究結(jié)果對于完善黃連種子的休眠機理，探索解除種子休眠的方法提供理論參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

黃連種子于2016年5月底采集于四川省雅安市天全鄉(xiāng)小溝村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為毛茛科植物黃連（Coptis chinensisFranch.）的種子。

1.2 實驗儀器

RZH-0450型低溫人工氣候箱（杭州會兒儀器設(shè)備有限公司）、全自動樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48上海凈信科技）、離心機（Hitachi centrifuge CT15RE）、移液槍（eppeudorf Research plus）、酶標(biāo)儀(Thermo scientificTM varioskanTM FLASH) 、96孔板、2 mL EP管等。

1.3 試劑試藥

丙二醛（MDA）、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 種子層積處理

模擬自然環(huán)境，將種子與濕沙（濕沙以手握成團(tuán)落地即散為度，保持良好的通氣并檢查基質(zhì)含水量）按重量1:4～1:6 比例混合，置于18 ± 1 ℃低溫人工氣候箱層積110 d后，將種子分為2份，1份原條件下繼續(xù)層積70 d（常溫層積）；另一份轉(zhuǎn)移至4 ± 1℃低溫人工氣候箱層積70 d（溫層積）。在層積過程中每隔10 d分別取樣，將種子用清水洗凈，晾干種子表面水分，以備測試。

2.2 抗氧化系統(tǒng)酶活性測定及丙二醛(MDA)的測定

每隔10d分別測定種子中丙二醛（MDA）含量及過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶(SOD)活性，按照試劑盒說明書進(jìn)行測定，每個指標(biāo)3次重復(fù)取平均值。

3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 進(jìn)行統(tǒng)計、繪圖，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，計算標(biāo)準(zhǔn)差、檢驗差異顯著性。

4 結(jié)果與分析

4.1 不同層積處理黃連種子過氧化物酶（POD）活性變化

從圖1中可以看出，黃連種子在兩種層積處理過程中，POD 活性總體來看呈現(xiàn)上升趨勢，層積處理130 d后呈顯著上升趨勢；且兩種層積處理過程中種子的POD活性變化趨勢保持高度一致；低溫處理種子中POD含量顯著高于常溫處理。方差分析結(jié)果表明，兩種層積處理中，對照（0 d）與層積180 d的POD活性差異顯著。

圖1 不同層積處理黃連種子過氧化物酶（POD）活性變化

4.2 不同層積處理黃連種子過氧化氫酶（CAT）活性變化

由圖2中可以看出，黃連種子在兩種層積處理過程中，CAT 活性總體來看呈現(xiàn)上升趨勢；隨著層積時間的延長，其含量呈現(xiàn)坡度式的增減。且兩種層積處理過程中種子的CAT活性變化趨勢保持高度一致。方差分析結(jié)果表明，兩種層積處理中對照（0 d）與層積180 d的CAT活性差異顯著。

圖2 不同層積處理黃連種子過氧化氫酶（CAT）活性變化

4.3 不同層積處理黃連種子超氧化物歧化酶（SOD）活性變化

由圖3中可以看出，黃連種子在兩種層積處理過程中，SOD 活性總體來看呈現(xiàn)上升趨勢；隨著層積時間的延長，其含量呈現(xiàn)坡度式的增減。方差分析結(jié)果表明，低溫層積處理中對照（0 d）與層積180 d的SOD活性差異顯著，常溫層積處理中對照（0 d）與層積180 d的SOD活性差異不顯著。

圖3 不同層積處理黃連種子超氧化物歧化酶（SOD）活性變化

4.4 不同層積處理黃連種子丙二醛（MDA）含量變化

由圖4中可以看出，黃連種子在兩種層積處理過程中，MDA 含量總體來看呈現(xiàn)上升趨勢；隨著層積時間的延長，其含量呈現(xiàn)坡度式的增減；低溫處理種子中MDA含量大多低于常溫處理。方差分析結(jié)果表明，兩種層積處理中對照（0d）與層積180d的MDA活性差異顯著。

圖4 不同層積處理黃連種子丙二醛（MDA）含量變化

5 討論

過氧化物酶普遍存在于生物體內(nèi)，活性較高，與植物體內(nèi)多種生理活動有關(guān)。本次實驗中，兩種層積處理黃連種子POD 活性在層積后期顯著升高，說明經(jīng)過層積后，黃連種子具有較高的抗氧化酶活性，能夠有效降低因自由基活性氧過多而引起膜脂質(zhì)過氧化作用造成的膜損傷，保證黃連種子的活力；同時通過測定黃連種子層積過程中POD活性變化，可以了解種子休眠萌發(fā)過程中的生理代謝的活躍程度。從代謝上來看，有研究表明休眠種子的呼吸代謝以糖酵解．三羧循環(huán)(EMP-TC)途徑為主，而非休眠種子則以磷酸戊糖途徑(PPP)為主，要使種子打破休眠而萌發(fā)，必須使EMP-TC轉(zhuǎn)為PPP途徑，而POD活性的提高有利于PPP途徑的進(jìn)行,可能是促進(jìn)休眠解除的因子之一[6]。因此，黃連種子中貯藏的富含化學(xué)能的有機物，在層積后熟的過程中釋放出大量的能量，同時轉(zhuǎn)變成易于吸收的形態(tài)，向種胚提供形成新組織的所需物質(zhì)和能量，這些變化過程都必須要有酶的作用。黃連種子在兩種層積處理后期，低溫層積處理黃連種子POD活性更高，說明在此低溫條件下更有利于逐步解除種子的體眠，從而促進(jìn)種子萌發(fā)，這與自然狀態(tài)下黃連種子的后熟特性保持一致，因此現(xiàn)在藥農(nóng)在處理黃連種子時多采用低溫層積處理。

目前，人們對SOD和CAT兩種酶的作用還不十分清楚，但其在呼吸作用中去除超氧陰離子自由基的作用已廣為接受。植物呼吸時，線粒體的電子漏可引起呼吸鏈電子傳遞出現(xiàn)短路途徑。如在呼吸鏈輔酶Q處發(fā)生電子漏，產(chǎn)生的超氧陰離子自由基(O2-)在線粒體SOD催化下歧化為H2O2，H2O2在CAT作用下形成H2O，便減少了O2-對植物體的危害[7-8],由此可見SOD和CAT共同作用于清除具有毒性的O2-，二者活性具有相關(guān)性。本實驗測定CAT、SOD活性的變化規(guī)律也基本保持一致，證明CAT與SOD二者之間相互協(xié)同發(fā)揮清除自由基活性氧作用。且黃連種子層積處理后期隨著MDA含量增加，CAT、SOD的活性也隨之增強，使得體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡中，維持了活性氧代謝平衡，以保證黃連種子在長達(dá)近4個月的后熟層積過程中細(xì)胞膜不受傷害以及種子發(fā)育的正常進(jìn)行。

丙二醛是膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，具有細(xì)胞毒性，能與膜結(jié)構(gòu)上的蛋白質(zhì)和酶結(jié)合、交聯(lián)而使之失去活性，從而破壞膜結(jié)構(gòu)[9]。通過測定種子層積過程中MDA含量變化，可以了解種子休眠萌發(fā)過程中的種子的活力。本試驗黃連種子在兩種層積處理種子內(nèi)部MDA含量均增加，且前期MDA緩慢增加，這表明層積初期，自由基活性氧產(chǎn)生較少，酶促保衛(wèi)系統(tǒng)協(xié)同發(fā)揮作用，能有效抵御其造成的傷害。但后期隨著層積時間的延長，丙二醛含量均呈現(xiàn)坡度式增減，說明在此過程中種子中不斷產(chǎn)生了自由基活性氧，又不斷被種子體內(nèi)的抗氧化酶清除，但其調(diào)節(jié)能力有限，因而體內(nèi)還是積累了過剩的氧自由基，這些氧自由基又引起膜的過氧化，產(chǎn)生了大量的MDA，使MDA含量上升。且在兩種層積處理后期，低溫層積處理黃連種子MDA的含量活性更低，說明在此低溫條件下更有利于黃連種子活力的保持，這與自然狀態(tài)下黃連種子的后熟特性也保持一致。

6 結(jié)論

實驗證明，與恒溫層積相比，變溫層積黃連種子抗氧化酶活性與恒溫層積有一定差異。這些現(xiàn)象表明變溫環(huán)境下更有利于黃連種子的后熟。種子內(nèi)抗氧化酶活性升高，種子內(nèi)的代謝過程也被激發(fā)，為種子的萌發(fā)提供代謝準(zhǔn)備，從而使其具有了較好的促進(jìn)休眠解除的作用。因此，結(jié)合黃連種子層積中的抗氧化酶的變化規(guī)律，結(jié)合藥農(nóng)多年來的層積規(guī)律，該結(jié)果可以為進(jìn)一步黃連種子育苗提供有力支撐。

[1] 楊淑慎,高俊鳳.活性氧、自由基與植物的衰老[J]. 西北植物報,2001 (02):215.

[2] 張永峰,殷 波. 混合鹽堿脅迫對苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2009( 01):46.

[3] 段承俐,李章田,丁金玲,等. 三七種子的后熟生理特性研究[J].中國中藥雜志,2010 (20):2652.

[4] 柳 鑫,黃 河,黃璐琦,吳和珍,等.黃連藥材原植物資源和市場品種調(diào)查[J].中國藥師, 2014 (10):1691-1695.

[5] 張春平,何 平,何俊星,等. 藥用保護(hù)植物黃連種子萌發(fā)特性研究[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008, 9:893.

[6] Robert. E H. Oxidative process and the control of germination.“Seed Ecology” [M].London butter-worth.1973, 18.

[7] 田國忠,李懷方,裘維蕃.植物過氧化物酶研究進(jìn)展．武漢植物學(xué)研究,2001,19(4):332.

[8] Huff A. Peroxides-catalysed oxidation of chlorophyll by hydrogen peroxide[J]. Phytochemistry, 1982, 21:261.

[9] 李 明,王根桿.干旱脅迫對甘草幼苗保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].生態(tài)學(xué)報, 2002,(04):503.

(責(zé)任編輯：李蕓霞)

Study on the dynamic changes of antioxidant enzyme activity in seeds of Huanglian during after-ripening process/

LUO Tingting, MA Yun-tong, PEI Jin, ZOU Yu-xia, ZHOU Bi-qian, ZHONG Fu-rong//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To investigate the dynamic changes of antioxidant enzymes activity of Huanglian seeds during afterripening process.Method:The antioxidant enzymes activity of Huanglian were detected after strati fi cation of the seeds at 4 ± 1℃(low temperature) and 18 ± 1 ℃ (normal temperature) respectively.Result:The activities of peroxidase (POD), catalase (CAT),superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) showed increasing trend during after-ripening process. The content of peroxidase (POD) in the seeds treated at low temperature was signi fi cantly higher than that treated at normal temperature. And no signi fi cant difference of the activities of other antioxidant enzymes was found.Conclusion:Through the interaction among antioxidant enzymes, the effect of reactive oxygen on the cell structure integrity are effectively eliminated in Huanglian seeds, and the morphological and physiological maturation during after-ripening process are promoted , which ensure the seed germination.

Huanglian seeds; after-ripening; antioxidant enzymes; dynamic change

R 282.2

A

1674-926X(2017)03-001-03

中藥種質(zhì)資源庫建設(shè)關(guān)鍵技術(shù)研究及示范(2014SZ0156)中藥資源四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(20151100028)

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

羅婷婷(1991-)，女，碩士生，從事中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Email:759693714@qq.com Tel:18280131227

馬云桐(1963-)，男，教授，從事中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Email:mayuntong06@163.com Tel:13980598196

2016-10-08