程龍，熊雯，陳霞

過敏康膠囊微生物限度檢查的方法建立

程龍，熊雯，陳霞

目的：建立過敏康膠囊的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國藥典》2015年版，采用常規(guī)法對需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數、以及控制菌的檢查進行方法學驗證。結果：過敏康膠囊的抑菌性較小，可采用常規(guī)法進行需氧菌總數計數、霉菌及酵母菌總數計數和控制菌的檢查。結論：建立的方法準確可靠，可用于過敏康膠囊的微生物限度檢查。

過敏康膠囊；微生物限度檢查；常規(guī)法；方法驗證

過敏康膠囊是以黃芪、防風、黃芩、丹皮、烏梅和百合為主要成分的口服給藥固體制劑，按照《中國藥典》2015年版四部非無菌藥品微生物限度標準規(guī)定，確定其標準為需氧菌總數每1 g不得過104 cfu，霉菌和酵母菌總數每1 g不得過102 cfu，大腸埃希菌每1 g不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌應小于102 cfu/g，沙門菌每10 g不得檢出[1]?？紤]到黃芩[2,3,4]和防風[5]等成分對微生物生長有一定的抑制作用，故本品在進行微生物限度檢查時，應消除樣品的抑菌活性，建立一種可靠有效的，適合于本品的檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

超凈工作臺（蘇凈安泰）SW-CJ-2FD；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技）LRH-250；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技）GHP-7290。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)631001]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均來源于中國藥品生物制品檢定所，均為第4代培養(yǎng)物。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、腸道增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門增菌培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，均由北京三藥科技開發(fā)公司生產。

1.4 樣品

過敏康膠囊（批號：151204 151205 151206）

2 方法與結果

2.1 常規(guī)法驗證需氧菌總數計數

2.1.1 菌液制備 按照中國藥典2015年版制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉的菌懸液。

2.1.2 供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45 ℃水浴，得1:10供試液。

2.1.3 回收率測定

供試品對照組：

取1:10供試液50 mL，加入0.5 mLpH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，搖勻，取1 mL注入平皿，平行制備2個平皿，測定供試品本底需氧菌總數。

菌液對照組：

分別取上述5種試驗菌懸液0.5 mL，加至50 mLpH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，取1 mL注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數。

試驗組：

分別取上述5種試驗菌懸液0.5 mL，加至50 ml的1:10供試液中，混勻，取1 mL注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)3天，計數。

試驗組菌回收率：(試驗組菌數-供試品本底菌數)/菌液對照組菌數×100%。結果如表1所示。

表1 常規(guī)法驗證需氧菌總數試驗結果（cfu/皿）

如表1所示，本品采用常規(guī)法檢查，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉五種試驗菌的回收率均超過50%，故本品的需氧菌計數可采用常規(guī)法進行檢查。

2.2 常規(guī)法驗證霉菌及酵母菌總數

2.2.1 回收率測定

供試品對照組：

取1:10供試液50 mL，加入0.5 mL pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，搖勻，取1 mL注入平皿，平行制備2個平皿，測定供試品本底霉菌及酵母菌總數。

菌液對照組：

取白色念珠菌和黑曲霉菌懸液0.5 mL，分別加至50 mLpH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，取1 mL注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加的試驗菌數。

試驗組：

分別取白色念珠菌和黑曲霉菌懸液0.5 mL，加至50 ml的1:10供試液中，混勻，取1 mL注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，25℃培養(yǎng)5天，計數。

試驗組菌回收率：(試驗組菌數-供試品本底菌數)/菌液組菌數×100%。結果如表2所示。

表2 常規(guī)法驗證霉菌及酵母菌總數試驗結果（cfu/皿）

如表2所示，本品采用常規(guī)法檢查，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均高于50%，因此，本品霉菌及酵母菌總數計數可采用常規(guī)法。

2.3 控制菌檢查方法的驗證

2.3.1 常規(guī)法檢查大腸埃希菌

試驗組：

取1:10供試液10 ml及制備好的大腸埃希菌懸液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。吸取1 ml培養(yǎng)物接種至100 ml 麥康凱液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24小時，觀察是否有菌落生長。

陽性對照組：

取制備好的大腸埃希菌懸液1 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

陰性對照組：

取10 ml pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

供試品對照組：

取1:10供試液10 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

表3 大腸埃希菌檢查方法(胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基:100 mL)驗證結果

由表3可知，陰性對照組和供試品對照組均未檢出大腸埃希菌，陽性對照組和試驗組的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有典型菌落生長，因此，本品大腸埃希菌可用常規(guī)法進行檢查。

2.3.2 常規(guī)法檢查耐膽鹽革蘭陰性菌

供試液制備：

取本品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，45 ℃水浴，得1:10供試液，于25 ℃培養(yǎng)2 h，備用。

試驗組：

取1:10供試液10 ml及制備好的大腸埃希菌懸液1 ml加入到100 ml的腸道增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24小時，觀察是否有菌落生長。

取1:10供試液10 ml及制備好的銅綠假單胞菌懸液1 ml加入到100 ml的腸道增菌液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24小時，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24小時，觀察是否有菌落生長。

陽性對照組：

取制備好的大腸埃希菌懸液和銅綠假單胞菌懸液各1 ml分別加入到兩份100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

陰性對照組：

取10 ml pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

供試品對照組：

取1:10供試液10 ml加入到100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

結果如下表：

表4 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法驗證結果

由表4可知，陰性對照組和供試品對照組均無菌落生長，陽性對照組和試驗組的紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上均有典型菌落生長，因此，本品耐膽鹽革蘭陰性菌可用常規(guī)法進行檢查。

2.3.3 常規(guī)法檢查沙門菌

試驗組：

取供試品10 g及制備好的沙門菌懸液1 ml加入到200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。吸取0.1 ml培養(yǎng)物接種至10 ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24小時，觀察是否有典型菌落生長。

陽性對照組：

取制備好的沙門菌懸液1 ml加入到200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

陰性對照組：

取10 ml pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

供試品對照組：

取供試品10 g加入到200 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24小時。其他操作同試驗組。

表5 沙門菌檢查方法(胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基:200 mL)驗證結果

由表5可知，陰性對照組和供試品對照組均未檢出沙門菌，陽性對照組和試驗組的木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基上有典型菌落生長，因此，本品沙門菌可用常規(guī)法進行檢查。

3 討論

本品對細菌及真菌的抑制作用較小，可采用常規(guī)法進行需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數、大腸埃希菌檢查、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查和沙門菌檢查。根據驗證結果將微生物限度檢查方法記錄如下：取本品10 g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，45 ℃水浴溶解，得1:10供試液。需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數、大腸埃希菌檢查、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查以及沙門菌檢查均可采用常規(guī)法。

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[2] 朱廣平,徐曉玲. 黃芩對制劑微生物限度檢查方法的影響[J].無線互聯(lián)科技,2014,6:219.

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[4] 白林,黃曉舞，高翠萍. 不同廠家牛黃解毒片抑菌作用的比較[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2013,23(2):444.

[5] 于鳳平,代秀梅. 防風通圣丸微生物限度檢查方法學驗證[J].中國藥師,2010,11:1679.

(責任編輯：傅舒)

Validation of microbial limit test method of Guominkang capsule/

CHENG Long, XIONG Wen, CHEN Xia//(Chengdu Institutes for Food and Drug Control, Chengdu 610000, Sichuan)

Objective:To establish the method to determine the microbial limit test for Guominkang capsule.Method:According to China Pharmacopoeia 2015 edition, the routine method was performed to detect the amount of aerobic bacteria,mycete, saccharomycetes, and validate the test controlling bacteria of Guominkang capsule.Result:Guominkang capsules hardly had the antimicrobial activity. The routine method was feasible for the count of amount of aerobic bacteria, mycete,saccharomycetes, and the test controlling bacteria of Guominkang capsule.Conclusion:The method is accurate and can be used for the microbial limit test of Guominkang capsules.

Guominkang capsules; microbial limit test; the routine method; validation of method

R 285.5

A

1674-926X(2017)03-011-04

成都市食品藥品檢驗研究院 成都 610000

程龍（1983-），男，碩士研究生，微生物檢驗技術中級，主要從事藥品質量控制研究

Tel:028-85362197 Email:32939152@qq.com

2016-12-5