閔志強(qiáng)，蔣淼，石婭萍

基于Caco-2細(xì)胞模型研究青黛配方分散片吸收機(jī)制

閔志強(qiáng)，蔣淼，石婭萍

目的：探討青黛跨膜吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。方法：采用Caco-2細(xì)胞模型，進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，說明藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方式，并比較兩種青黛區(qū)別，最后考察不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑?qū)η圜旆稚⑵c原劑型有效成分的轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響。結(jié)果：固體分散技術(shù)可以促進(jìn)青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，該轉(zhuǎn)運(yùn)為被動轉(zhuǎn)運(yùn)過程，轉(zhuǎn)運(yùn)吸收不受P-gp、MRP和CYP3A4影響。結(jié)論：固體分散技術(shù)可通過青黛溶解度促進(jìn)其有效成分的吸收。

青黛；固體分散；Caco-2細(xì)胞模型；吸收機(jī)制

Caco-2細(xì)胞模型是目前最為成熟和應(yīng)用最多的體外吸收模型，可用于快速評估新藥的細(xì)胞滲透性、闡明藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑、評價(jià)提高膜通透性的方法等，成為藥物吸收研究的有力工具[1]。青黛配方分散片是我們采用固體分散技術(shù)，將青黛制備成一種以分散片為劑型，擬在臨床上作為中藥配方顆粒使用的新型飲片。本論文采用Caco-2細(xì)胞模型研究青黛配方分散片轉(zhuǎn)運(yùn)特性，從細(xì)胞水平考察青黛配方分散片吸收機(jī)制，為證實(shí)固體分散技術(shù)提高能青黛吸收提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試藥

Caco-2細(xì)胞株(美國ATCC公司)；青黛配方分散片，實(shí)驗(yàn)室自制；青黛飲片，四川江油恒源藥業(yè)提供，批號120301； DMEM培養(yǎng)基、高滅活胎牛血清(Fetalbovineseurm)、非必須氨基酸、谷氨酰胺、青/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、DMSO。酮康唑膠囊(南京白敬宇制藥有限公司,批號：H10900055)、鹽酸維拉帕米片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán),批號：H45010807)；丙磺舒(上海集成藥廠，批號：140601)；HPLC所用有機(jī)溶劑均為色譜純，其余為分析純。

1.2 儀器

美國Agilent1100高效液相儀；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司);跨膜電阻儀(Millipore公司);電熱恒溫水箱;倒置顯微鏡；恒溫?fù)u床。

2 方法

2.1 Caco-2 細(xì)胞模型培養(yǎng)

將 Caco-2 細(xì)胞置于含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1萬單位/mL青霉素-鏈霉素雙抗液的 DMEM培養(yǎng)基中，在 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞生長至孔面積的 80%左右，用胰酶消化且傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以 1×105/mL 的密度接種于 Transwell小室中，頂側(cè)（AP）與底側(cè)（BL）分別加 0.5、1.5 mL 培養(yǎng)基，隔天換液，7 d 后每天換液，培養(yǎng)至 21 d，對跨膜電阻、細(xì)胞形態(tài)、酶表達(dá)、標(biāo)志物甘露醇跨膜通量參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，合格后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 Caco-2細(xì)胞模型的評價(jià)

2.2.1 細(xì)胞跨膜電阻 通過測量單細(xì)胞層的跨膜電阻來評價(jià)Caco-2 細(xì)胞是否分化成完整的單層膜，一般而言TEER值大于500 Ω/cm2時(shí)即表明CACO-2 細(xì)胞完全分化。本試驗(yàn)中采用電位儀監(jiān)測Caco-2細(xì)胞在聚碳酯膜上生長21天時(shí)的TEER。結(jié)果在21天時(shí)TEER值已達(dá)634.32 Ω/cm2（＞500）,，表明 Caco-2 細(xì)胞單層已形成，可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 用倒置顯微鏡觀察Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)21天時(shí)細(xì)胞單分子層的形態(tài)。結(jié)果Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)21天后，細(xì)胞分化與極化基本完成，表明可用于轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

2.2.3 酶（堿性磷酸酶AKP）表達(dá) 分別取AP和BL培養(yǎng)液，用AKP試劑盒，測其AKP活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP側(cè)與 BL 側(cè)的堿性磷酸酶活性比值接近 3∶1，表明兩側(cè)極化已形成。

2.2.4 跨膜通量 采用甘露醇作為標(biāo)志物檢測所培養(yǎng)細(xì)胞的完整性，細(xì)胞符合要求后即用于實(shí)驗(yàn)。將Caco-2細(xì)胞以前述培養(yǎng)方法培養(yǎng)于Millicell TM膜中,培養(yǎng)21天,待用。將3H-甘露醇用空白HBSS配制成0.5 U Ci/mL的溶液。取在Millicell TM系統(tǒng)中生長了21天的Caco-2細(xì)胞模型,向其APical(AP)側(cè)加入甘露醇溶液0.5 ml,BasolateraKBL)側(cè)加入pH7.4的空白HBSS2.0 ml,置于37 ℃的振蕩水槽中,50 rpm振蕩。培養(yǎng)2 h后,測定BL側(cè)中透過的3H-甘露醇的含量,計(jì)算其透過百分率，若通透量小于0.5%/h,則表明已經(jīng)形成緊密的細(xì)胞單分子層結(jié)果，結(jié)果21天的通透率實(shí)測值為0.17%。

2.3 HPLC測試色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18(4.6×250 mm,5 μm)；檢測波長：288 nm，流動相：甲醇:水（70:30），流速：1.0 mL．min-1，柱溫為25 ℃。

供試品溶液的制備：吸取接收池中的樣品溶液100 μL,于離心機(jī)中離心15 min(13000 r/min),取上清液10 μL進(jìn)樣。

2.4 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

將青黛原飲片與分散片分別用DMSO超聲溶解，并用HBSS液稀釋為含靛玉紅2.5 μg/ml、靛藍(lán)50 μg/ml的藥液，備用。取符合“2.1”項(xiàng)下條件的轉(zhuǎn)運(yùn)孔，在實(shí)驗(yàn)前用37 ℃預(yù)熱的HBSS 液蕩洗 3 次，最后 1 次在 37 ℃培養(yǎng)箱中溫孵 30 min，吸去廢液。在 AP 側(cè)至 BL 側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，AP 側(cè)加藥液 0.5 mL，BL側(cè)加空白HBSS液 1.5 mL，設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔；在BL 側(cè)至 AP 側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)中，AP 側(cè)加空白HBSS液0.5 mL，BL 側(cè)加藥液 1.5 mL，設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔。給藥后將 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒溫?fù)u床中，分別于 15、30、45、60、75、90 min 從接收池內(nèi)取樣100 μL，同時(shí)用空白HBSS 液補(bǔ)足，HPLC檢測。按照下列公式計(jì)算藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量、表觀滲透系數(shù)、外排比率等參數(shù)

藥物在各時(shí)間點(diǎn)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量(Qn)以下式表示，Qn=CnV+ ，其中,n為取樣次數(shù);V為接收池體積;c為樣品濃度;Vi為每次取樣體積。

表觀滲透系數(shù)(apparentper meability coefficient,Papp)，Papp=Q/Act，式中,Papp是表觀滲透系數(shù)(cm2/min);Q是透過的靛玉紅/靛藍(lán)總量(μg);A為擴(kuò)散面積(cm2) ,本實(shí)驗(yàn)中A為1.12 cm2;c是開始時(shí)施藥池中靛玉紅/靛藍(lán)濃度(μg/mL);t是總實(shí)驗(yàn)時(shí)間(min)。

外排比率（ER)：ER= Papp（B-A）/ Papp（A-B）。如該比值大于2，則表示藥物在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)有方向性，有外排轉(zhuǎn)運(yùn)體參與。

2.5 細(xì)胞吸收影響因素及影響藥物試驗(yàn)

將兩種青黛藥液分別在 37 ℃下與不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑溶液混合, AP 側(cè)加藥液 0.5 mL，BL側(cè)加空白HBSS液 1.5 mL，設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，給藥后將 24 孔板置于 37 ℃、50 r/min 的恒溫?fù)u床中，分別于90 min從接收池內(nèi)取樣 100 μL，同時(shí)用空白HBSS 液補(bǔ)足，HPLC檢測，觀察以上三種抑制劑對青黛吸收的影響，以及兩種青黛之間的區(qū)別。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

各藥物組別不同時(shí)間段的Papp值均采用spss 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,并進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見表1及圖1-2，由結(jié)果可見，靛藍(lán)和靛玉紅在兩側(cè)的吸收ER＜2，說明藥物在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)沒有方向性，屬于被動轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)與原劑型相比，青黛分散片有效成分Papp有明顯（p＜0.05,p＜0.01）增高，說明分散片劑型有助于吸收。

表1 雙向運(yùn)轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.2 細(xì)胞吸收影響因素及影響藥物試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2，可見不同濃度的P-gp、MRP和CYP3A4抑制劑維拉帕米、丙磺舒和酮康唑?qū)η圜旆稚⑵c原劑型有效成分的轉(zhuǎn)運(yùn)量無明顯影響（p＞0.05），說明靛玉紅、靛藍(lán)不是這三種物質(zhì)的底物,吸收不受這三種物質(zhì)調(diào)節(jié)。

表2 影響藥物試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

4 討論及結(jié)論

青黛作為一味典型的中藥粉末飲片，因其主要成分均難溶于水，不宜入湯劑煎服；又因青黛飲片為固體團(tuán)粒狀粉末，質(zhì)地疏松輕浮，極易飛揚(yáng)，以藥湯送服常引起嗆咳，尤其是兒童無法服用。由于該藥服用不方便，目前臨床用法主要為水煎，利用率極低，療效難以保證。為解決這一問題，使青黛既能在臨床上得到正確應(yīng)用，又方便患者服用，我們采用了固體分散技術(shù)，將青黛制備成配方分散片[2～4]，以分散片為劑型，在臨床上作為中藥配方顆粒使用，該技術(shù)已于2012年獲得專利授權(quán)[5]。將分散片劑型用于配方顆粒，既保持了傳統(tǒng)中藥飲片性質(zhì)，又符合中醫(yī)臨床用藥要求，可隨癥加減。同時(shí)產(chǎn)品質(zhì)量可控可測，崩解迅速，能提高藥物吸收度。在前期，我們已經(jīng)初步證實(shí)了青黛配方分散片可提高其有效成分的在體吸收[6]，本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備進(jìn)一步明確青黛配方分散片的促進(jìn)吸收機(jī)制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證實(shí)固體分散技術(shù)可以促進(jìn)青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)推斷青黛有效成分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)被動轉(zhuǎn)運(yùn)過程，吸收與P-gp、MRP和CYP3A4無關(guān)，因而可以通過增加其有效成分的溶解度和溶出來提高其生物利用度,所以證實(shí)了通過固體分散技術(shù)將青黛飲片制作為分散片劑型可提高其吸收是非常合理，極其有效的一種做法，值得推廣。

[1] 馬博,孫桂波,楊志宏,等. 腸上皮細(xì)胞模型不同培養(yǎng)條件的優(yōu)化及適應(yīng)性研究[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17( 11) : 205

[2] 閔志強(qiáng),葉英杰,張廷模,等.青黛不宜入湯劑的考證[J].四川中醫(yī),2010, 28 (1):52-54

[3] 葉英杰,閔志強(qiáng),楊明,等.青黛分散片制備工藝研究[J].中藥藥理與臨床,2010,1(2):29-31

[4] 閔志強(qiáng).青黛配方分散片研究[D].博士學(xué)位論文,成都中醫(yī)藥大學(xué),2010年

[5] 閔志強(qiáng),張廷模.一種青黛飲片及其制備方法[P].專利號:ZL 2010 1 0551085.4

[6] 閔志強(qiáng),陳科,李亞麗,等.青黛配方分散片對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及大鼠原位灌注試驗(yàn)[J].中藥藥理與臨床, 2010, 26 (4):38-40

(責(zé)任編輯：傅舒)

Study on the absorption mechanism of Qingdai formula dispersible tablets based on Caco-2 cell/

MIN Zhi-qiang, JANG Miao, SHI Ya-ping//(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To explore the absorption mechanism of Qingdai.Method:Two-way transport experiments were conducted using Caco-2 cell model to explore drug transport way, and compare the difference between two kinds of Qingdai.Then, the influence of different concentrations of P-gp, MRP and CYP3A4 inhibitor verapamil, probenecid and ketoconazole on the transport of effective components of Qingdai dispersion tablets and the original formulation were investigated.Result:Solid dispersion technology can promote the transmembrane transport of effective components of Qingdai. The transport was passive transport which was not affected by P-gp, MRP and CYP3A4.Conclusion:Solid dispersion technology can promote the absorption of active ingredients of Qingdaiby increasing the solubility.

Qingdai; solid dispersion; Caco-2 cell model; absorption mechanism

R 283.3

A

1674-926X(2017)03-012-03

四川省教育廳資助科研項(xiàng)目 利用固體分散技術(shù)提高青黛飲片藥效及吸收機(jī)制研究 編號14ZB0098

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137;

閔志強(qiáng)（1979-），男（漢），講師，博士，主要從事中藥藥性理論與臨床應(yīng)用

Tel:13880641950 Email:minzq@qq.com

石婭萍（1978-），女（漢），講師，博士，主要從事中藥安全性評價(jià)

Tel:18982260169 Email:stone78520@163.com

2016-12-05