蘆智遠 ,馮歆軼 ,汪靜雯 ,徐斐 ,楊琦
(1.西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,西安 710065; 2.陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院,西安 710100)
固相萃取–高效液相色譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的殘留量
蘆智遠1,馮歆軼1,汪靜雯2,徐斐1,楊琦1
(1.西安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,西安 710065; 2.陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院,西安 710100)
建立了測定豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的固相萃取–高效液相色譜法。樣品以0.1 mol/L的鹽酸溶液為提取劑,經(jīng)C18固相萃取柱凈化處理,以乙腈–10 mmol/L乙酸銨水溶液(體積比25∶75)為流動相,TechMate C18–ST色譜柱分離,4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的紫外檢測波長分別為228 nm和267 nm,色譜峰面積外標法定量。在0.50~100.00 mg/L濃度范圍內(nèi),4-氯苯氧乙酸鈉的相關系數(shù)為0.999 8,精密度在1.3%~8.2%之間(n=6),回收率在103.1%~109.0%之間;在0.05~10 mg/L濃度范圍內(nèi),6-芐基腺嘌呤相關系數(shù)為0.999 9,精密度在0.9%~3.8%之間(n=6),回收率在88.0%~95.4%之間。4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的檢出限(S/N=3)分別為0.24,0.02 mg/kg。該法可以同時完成豆芽中4-氯苯氧乙酸鈉和6-芐基腺嘌呤的分析檢測。
豆芽;4-氯苯氧乙酸鈉;6-芐基腺嘌呤;高效液相色譜法;固相萃取
豆芽富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、鈣、維生素,營養(yǎng)價值高,為廣大消費者所喜愛,市場需求量大[1]。為了促進豆芽萌發(fā),栽培中濫用植物生長調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象頻繁發(fā)生,其中常見的植物生長調(diào)節(jié)劑有4-氯苯氧乙酸鈉,6-芐基腺嘌呤等。4-氯苯氧乙酸鈉(4-Chlorphenoxyacetic acid sodium,CPANa)又名防落素,為白色針狀或棱狀結晶,易溶于水,性質(zhì)穩(wěn)定。據(jù)研究,攝入CPA-Na會導致兒童發(fā)育早熟、女性生理發(fā)生變化、老年人骨質(zhì)疏松,甚至誘發(fā)致癌、致畸等嚴重后果[2–3]。6-芐基腺嘌呤(6-Benzylaminopurin,6-BA)屬細胞分裂素,白色或類白色晶體,難溶于水,微溶于乙醇,在酸、堿中性質(zhì)穩(wěn)定。6-BA具有一定的毒性,人體過量攝入會使食道、胃黏膜受到損傷,引發(fā)惡心、嘔吐等現(xiàn)象[4–5]。2011年,衛(wèi)生部監(jiān)督函919號公告中規(guī)定6-芐基腺嘌呤不得在豆芽生產(chǎn)中使用,同時GB 2760–2011,GB 2760–2014中取消了其作為食品添加劑的使用限量。
CPA-Na和 6-BA 的檢測方法有液相色譜法[6–10]、液相色譜 – 質(zhì)譜聯(lián)用法[11–12]、離子色譜法[13]、薄層色譜法[14]、毛細管電泳法[15]等,其中液相色譜法的應用相對廣泛。然而上述方法多是針對一種化合物進行分析,無法同時測定兩種化合物。筆者擬采用固相萃取–高效液相色譜法同時測定豆芽中CPANa和6-BA的殘留量,通過建立極性環(huán)境的提取條件,比較不同類型固相萃取柱對目標物的保留效果,分析不同流動相和添加劑對CPA-Na和6-BA分離的影響,從而建立一種操作簡單、分析準確的CPANa和6-BA的檢測方法。
液相色譜儀:Agilent 1260型,配有二極管陣列檢測器,美國安捷倫科技有限公司;
離心機:Anke型,上海安亭科學儀器廠;
固相萃取裝置:VISPREP型,美國Supelco公司;
固相萃取柱:C18,HLB 型,200 mg/(6 mL),德國CNW公司;
陰離子交換柱:Oasis MAX混合型,150 mg/(6 mL),美國 Waters公司;
高速分散均質(zhì)機:FJ 200–S型,上海標本模型廠;
甲醇、乙腈、甲酸:色譜純;
鹽酸、乙酸銨:優(yōu)級純;
磷酸二氫鈉:分析純;
CPA-Na,6-BA:純度均為99%,源葉生物有限公司;
綠豆:購于陜西野森林食品有限公司,在實驗室發(fā)制豆芽用作空白樣品;
實驗用水為超純水。
CPA-Na標準儲備液:1 mg/mL,以甲醇為溶劑配制;
6-BA標準儲備液:1 mg/mL,以甲醇為溶劑配制;
CPA-Na與6-BA混合標準工作液:各取CPANa與6-BA標準儲備液適量,用甲醇稀釋配制并于4℃冰箱中避光儲存。
色 譜 柱:TechMate C18–ST柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:CPA-Na 228 nm,6-BA 267 nm ;流動相:乙腈 –0.01 mol/L 乙酸銨 (25∶75);流量:1 mL/min;進樣體積:10 μL。
將豆芽粉碎,打漿,取樣品2.0 g,用0.1 mol/L鹽酸定容至10 mL,均質(zhì)提取1 min,以10 000 r/min轉速離心5 min,取上清液備用。
在固相萃取裝置上安裝C18小柱,用3 mL甲醇活化小柱,用3 mL水平衡后吸取3 mL上清液過柱,控制流量為2~3 mL/min,然后用3 mL水淋洗,最后用3 mL甲醇洗脫收集,混勻后供HPLC分析。
CPA-Na易溶于水,6-BA難溶于水,但6-BA中的腺嘌呤基團是一類含有兩個相鄰的碳氮環(huán)的含氮化合物,從而使6-BA具有堿性化合物的特性,因此可以通過降低水系提取溶液的pH值,增加6-BA在水中的溶解度。在溫度25℃條件下,采用平衡法測定6-BA在0~0.5 mol/L鹽酸溶液中的溶解度。結果見表1。
表1 鹽酸濃度對6-BA溶解度的影響
由表1可知,當鹽酸濃度小于0.1 mol/L時,6-BA溶解度隨鹽酸濃度增大而增大;當鹽酸濃度高于0.1 mol/L時,6-BA的溶解度基本不變。因此確定提取溶劑中鹽酸的濃度為0.1 mol/L。
分別選取HLB,C18,MCX,MAX 4種固相小柱,以10 mg/kg加標空白樣品的回收率為指標,分析比較CPA-Na和6-BA使用不同固相萃取柱凈化的效果。HLB,C18型固相萃取小柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進行活化平衡處理,3.0 mL樣品過柱,加入3.0 mL水淋洗小柱,棄去淋洗液,加入3.0 mL甲醇,收集流出液,供HPLC分析;MCX柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進行活化平衡處理,3.0 mL樣品過柱,依次加入3.0 mL水、3.0 mL甲醇淋洗小柱,棄去淋洗液,使用2.0 mL 5%氨水的甲醇溶液洗脫,收集洗脫液,于40℃下氮吹至近干,加入3 mL甲醇,震蕩后供HPLC分析;MAX柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水進行活化平衡處理,3.0 mL樣品過柱,依次加入3.0 mL水、3.0 mL甲醇淋洗小柱,棄去淋洗液,使用2.0 mL 2%甲酸的甲醇溶液進行洗脫,收集洗脫液,40℃下氮吹至近干,加入3 mL甲醇,震蕩后供HPLC分析。
經(jīng)過C18,HLB,MCX,MAX 4種固相萃取柱前處理后,比較CPA-Na和6-BA的回收率,結果如圖1所示。
圖1 HLB,C18,MCX,MAX固相萃取柱前處理后CPA-Na、6-BA的回收率
由圖1可知,MCX柱對CPA-Na不能有效保留,而6-BA回收率良好,MAX柱僅CPA-Na回收率較好,因此離子交換法不適用于CPA-Na和6-BA的同時富集;采用HLB和C18小柱,兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的回收率均較好,但相對C18,HLB成本較高,因此采用C18柱作為CPA-Na和6-BA的固相萃取柱。
以100 mg/L CPA-Na與10 mg/L 6-BA混合標準溶液作為待測液,比較乙腈–水、甲醇–水兩種流動相,及 10 mmol/L 乙酸銨、1% 甲酸、10 mmol/L磷酸二氫鈉3種添加劑在不同流動相配比條件下對CPA-Na和6-BA分離的影響。CPA-Na的掃描波長為228 nm,6-BA的掃描波長為267 nm。流動相組成、配比及色譜峰及分離情況見表2。由表2可知,以乙腈–10 mmmol/L乙酸胺(25∶75)為流動相,CPA-Na和6-BA可以得到有效分離,且目標物峰型良好,響應強度較高,色譜圖見圖2。
表2 流動相組成及配比、色譜峰及分離情況
圖2 流動相為乙腈–10 mmmol/L乙酸胺(25∶75)的色譜圖
CPA-Na和6-BA標準溶液的質(zhì)量濃度分別在 0.50~100.00,0.05~10.00 mg/L 范 圍 內(nèi) 與 對 應的色譜峰面積線性相關,相關系數(shù)分別為0.999 8,0.999 9,表明兩種植物生長調(diào)節(jié)劑線性均良好。選取未檢出CPA-Na和6-BA的豆芽作為空白基質(zhì),在1.0 mg/kg的添加水平下,以3倍信噪比計算方法檢出限,得到CPA-Na的檢出限為0.24 mg/kg,6-BA的檢出限為0.02 mg/kg。
以空白樣品作為基質(zhì),添加含量分別為1,10,50 mg/kg的加標樣品,平行測定 6次,結果見表3。由表3可知,CPA-Na測定結果的相對標準偏差為1.3%~8.2% (n=6),平均加標回收率為103.1%~109.0%;6-BA測定結果的相對標準偏差為0.9%~3.8% (n=6),平均加標回收率為88.0%~95.4%,可滿足分析要求。
表3 CPA-Na和6-BA的精密度及回收率(n=6)
通過降低水系提取溶劑的pH值,使用酸性水溶液提取豆芽中CPA-Na和6-BA,以固相萃取技術對樣品進行凈化處理,建立了測定豆芽中CPA-Na和6-BA殘留量的高效液相色譜法。該方法操作便捷,可以同時完成CPA-Na和6-BA的分析檢測,回收率高,精密度好,檢出限低,結果準確可靠。
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Determination of Residual of 4-Chlorobenzene Sodium Acetate and 6-Benzyladenine in Bean Sprout by SPE-HPLC
Lu Zhiyuan1, Feng Xinyi1, Wang Jingwen2, Xu Fei1, Yang Qi1
(1. Xi’an Product Quality Supervision and Inspection Institute, Xi’an 710065, China;2. College of Life Science and Food Engineering Shanxi Xueqian Normal University, Xi’an 710100, China)
The SPE-HPLC method for determination of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine in bean sprout was established. Samples were extracted with 0.1 mol/L hydrochloric acid and purified by C18SPE column. The target compounds were separated by TechMate C18–ST column with acetonitrile–10 mmol/L ammonium acetate solution (25∶75)as mobile phase. The UV detection wavelength of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine were 228 nm and 267 nm, respectively. The determinaion was performed by peak area with external standard method. The results showed that the linear range of 4-chlorobenzene sodium acetate was 0.5–100.00 mg/L with the linear correlation coefficients of 0.999 8,RSD of determination results were 1.3%–8.2% and the recoveries were ranged from 103.1% to 109.0%; the linear range of 6-benzyladenine was 0.05–10 mg/L (n=6) with the linear correlation coefficients of 0.999 9, RSD of determination results were 0.9%–3.8% (n=6) and the recoveries were ranged from 88.0% to 95.4%. The method detection limit of 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzyladenine were 0.24 mg/kg and 0.02 mg/kg, respectively. The method can be used to analyze 4-chlorobenzene sodium acetate and 6-benzylaminopurin in bean sprouts at the same time.
bean sprout; 4-chlorobenzene sodium acetate; 6-benzylaminopurin; high performance liquid chromatography; solid phase extraction
O657.7
A
1008–6145(2017)05–0055–04
10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.014
聯(lián)系人:蘆智遠;E-mail: 65651736@qq.com
2017–07–31