夏擁軍

(張家港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇張家港 215600)

高效液相色譜–原子熒光光譜法測(cè)定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)

夏擁軍

(張家港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇張家港 215600)

建立高效液相色譜–原子熒光光譜法對(duì)水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)［亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)、一甲基砷酸、二甲基砷酸］進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件：負(fù)高壓為270 V，燈電流為80 mA，原子化高度為10 mm，硼氫化鉀濃度為20 g/L (含5 g/L KOH)，載流為體積分?jǐn)?shù)5%的鹽酸。方法的線性范圍為0～100 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。各種砷形態(tài)的檢出限為0.20～0.45 μg/L；測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～4.81%(n=6)；加標(biāo)回收率為88.4%～101.7%。該方法靈敏度高，快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)成本低，可用于水產(chǎn)品中砷形態(tài)的檢測(cè)。

水產(chǎn)品；砷形態(tài)；液相色譜–原子熒光法

近年來(lái)，水產(chǎn)品的砷污染對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生的危害得到人們的高度關(guān)注。不同化學(xué)形態(tài)的元素在生物體內(nèi)發(fā)生的作用不同，因此目前元素檢測(cè)的趨勢(shì)是對(duì)各元素的化學(xué)形態(tài)進(jìn)行鑒別和定量，而不僅是對(duì)元素總量進(jìn)行測(cè)定［1–2］。砷是一種劇毒的非金屬元素，砷對(duì)人體的心血管、肝臟及腎臟皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)等都具有嚴(yán)重的損傷，被國(guó)家列為一級(jí)致癌物質(zhì)。砷的常見(jiàn)形態(tài)有亞砷酸鹽［As(Ⅲ )］、砷酸鹽［As(Ⅴ )］、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)?，F(xiàn)代研究表明，砷元素毒性的大小不僅與其總量有關(guān)，還與砷具體的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。在砷的各種形態(tài)中，無(wú)機(jī)砷［As(Ⅲ)，As(Ⅴ)］的毒性較大，而有機(jī)砷(DMA，MMA)的毒性相對(duì)較小。以砷化合物的半致死量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)有機(jī)砷的毒性進(jìn)行排序，由高到低依次為一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷膽堿 (AsC)、砷甜菜堿 (AsB)［3–5］。因此對(duì)砷進(jìn)行形態(tài)檢測(cè)具有重要的意義［6–7］。

在砷的形態(tài)檢測(cè)過(guò)程中，一般采用聯(lián)用技術(shù)對(duì)砷進(jìn)行形態(tài)分離，主要有高效液相色譜–電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子熒光光譜法、高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子吸收光譜法和毛細(xì)管電泳–電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法等［8–9］。上述檢測(cè)方法中，高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子熒光光譜法具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡(jiǎn)便、儀器使用維護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)［10］。

筆者采用硝酸–熱輔助提取法對(duì)水產(chǎn)品中砷化合物進(jìn)行提取，利用高效液相色譜結(jié)合原子熒光光譜技術(shù)對(duì)其中4種砷形態(tài)化合物進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化了氫化物發(fā)生條件，調(diào)整載流和還原劑的濃度，使待測(cè)物的信號(hào)達(dá)到最佳狀態(tài)，與高效液相色譜–電感耦合等離子質(zhì)譜法相比，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，可以用于水產(chǎn)品中砷形態(tài)化合物的日常檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–原子熒光聯(lián)用儀：AFS–LC200 型，北京海光儀器有限公司；

超純水發(fā)生器：美國(guó)Millipore公司；

電子天平：AT201型，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)；

高速離心機(jī)：X3R型，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

恒溫箱：FD115–45型，德國(guó)Binder公司；

pH計(jì)：DELTA 320型，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)；

砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(32.4±0.7) μg/g，編號(hào)為GBW 08667，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(124.3±2.0) μg/g，編號(hào)為GBW 08666，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

一甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(46.2±1.5) μg/g，編號(hào)為GBW 08668，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

二甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(97.4±3.3) μg/g，編號(hào)為GBW 08669，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

鹽酸溶液：量取100 mL鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

硝酸溶液：0.15 mol/L，量取 10 mL 硝酸 (優(yōu)級(jí)純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

氫氧化鉀溶液：5 g/L，稱(chēng)取5 g氫氧化鉀(優(yōu)級(jí)純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

硼氫化鉀溶液：20 g/L，稱(chēng)取20 g硼氫化鉀，用5 g/L氫氧化鉀溶液溶解并定容至1 000 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配；

磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀混合溶液：稱(chēng)取0.895 4 g磷酸氫二鈉、3.026 g磷酸二氫鉀，溶于500 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH至5.92，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過(guò)濾后，于超聲水浴中超聲脫氣30 min，備用；

魚(yú)、河蝦、大閘蟹、鮮貝樣品：市售；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水發(fā)生器制備的二級(jí)以上純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

砷混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確移取砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液［As(Ⅴ )］、亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液［As(Ⅲ )］、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水溶解稀釋?zhuān)?種砷形態(tài)溶液的質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L。

砷標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：取7只10 mL容量瓶，分別準(zhǔn)確加入1.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.00，0.050，0.10，0.20，0.30，0.50，1.0 mL，加水稀釋至標(biāo)線，混勻。此混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中4種砷形態(tài)的質(zhì)量濃度分別為 0.0，5.0，10.0，20.0，30.0，50.0，100.0 μg/L。

1.3 試樣處理

取樣品的可食部分勻漿，裝入潔凈的聚乙烯瓶中，密封，于冰箱中4℃冷藏備用。稱(chēng)取約1.0 g樣品(準(zhǔn)確至0.001 g)，置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL硝酸溶液，放置過(guò)夜。于90℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫。以8 000 r/min離心15 min，取5 mL上清液于離心管中，加入5 mL正己烷，振搖1 min，以8 000 r/min離心15 min，棄去上層正己烷。按此過(guò)程重復(fù)一次。吸取下層清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾及C18小柱凈化后進(jìn)樣。按同一操作方法做空白試驗(yàn)［11］。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 液相色譜

陰 離 子 交 換 柱：Hamilton PRP–X100柱（250 mm×4.1 mm，10 μm，北京海光儀器有限公司)；流動(dòng)相：磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀混合溶液(pH 5.92)，流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：100 μL；柱溫：40℃；液相色譜梯度洗脫程序：等度洗脫。

1.4.2 原子熒光光譜

還原劑：20 g/L硼氫化鉀溶液–5 g/L氫氧化鉀溶液；載流：5%的鹽酸溶液；負(fù)高壓：270 V；原子化器高度：10 mm；燈電流：80 mA；輔助燈電流：30 mA；載氣：氬氣，流量為400 mL/min；屏蔽氣：氬氣，流量為400 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件

2.1.1 提取劑濃度

配制不同濃度(0.05，0.08，0.10，0.12，0.15，0.18，0.20，0.22，0.25，0.30 mol/L)的硝酸溶液，對(duì)試樣分別提取后進(jìn)行測(cè)定，不同硝酸溶液濃度對(duì)應(yīng)的砷信號(hào)值見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，砷酸鹽、亞砷酸鹽、一甲基砷和二甲基砷的提取量隨硝酸濃度的提高而增加，當(dāng)硝酸濃度達(dá)到0.15 mol/L時(shí)，4種砷形態(tài)的提取量均達(dá)到最大值；當(dāng)硝酸濃度繼續(xù)增大時(shí)，4種砷形態(tài)的提取量保持穩(wěn)定增長(zhǎng)；當(dāng)硝酸濃度大于0.20 mol/L時(shí)，4種砷形態(tài)的提取量開(kāi)始下降。從環(huán)保的角度及提取率綜合考慮，選擇硝酸濃度為0.15 mol/L。

圖1 不同硝酸溶液濃度對(duì)應(yīng)的砷信號(hào)值

2.1.2 提取時(shí)間

固定提取劑硝酸溶液的濃度為0.15 mol/L，提取溫度為90℃，考察不同提取時(shí)間對(duì)砷提取效率的影響。結(jié)果表明，4種砷形態(tài)的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)，提取率達(dá)到最大；當(dāng)提取時(shí)間大于2.5 h時(shí)，提取率有下降的趨勢(shì)，可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致一部分砷損失?？紤]到工作效率和試劑成本，選擇提取時(shí)間為2.5 h。

2.2 原子熒光光譜儀工作條件的優(yōu)化

2.2.1 燈電流

原子熒光燈電流的大小，代表了激發(fā)光源的強(qiáng)弱。燈電流越大說(shuō)明激發(fā)光源越強(qiáng)，靈敏度越高；但燈電流過(guò)大不僅會(huì)引起一定程度的自吸，還會(huì)導(dǎo)致燈的使用壽命降低。不同燈電流對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)值見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)燈電流達(dá)到80 mA時(shí)，砷的熒光信號(hào)值最強(qiáng)，而當(dāng)燈電流繼續(xù)升高時(shí)，砷的熒光信號(hào)值基本保持穩(wěn)定，考慮到燈的使用壽命以及減少燈信號(hào)自吸等因素，選擇燈電流為80 mA。

圖2 不同燈電流對(duì)應(yīng)的砷信號(hào)值

2.2.2 光電倍增管負(fù)高壓

在儀器其它條件固定的情況下，改變光電倍增管的負(fù)高壓，觀察負(fù)高壓對(duì)砷信號(hào)值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)砷信號(hào)值隨負(fù)高壓的升高而增大，但負(fù)高壓過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致噪聲過(guò)強(qiáng)，信噪比降低；當(dāng)光電倍增管負(fù)高壓為270 V時(shí)，砷信號(hào)值最強(qiáng)；當(dāng)負(fù)高壓繼續(xù)升高時(shí)，砷的熒光信號(hào)值基本保持穩(wěn)定。綜合考慮，選擇光電倍增管負(fù)高壓為270 V。

2.2.3 載流鹽酸濃度

載流鹽酸濃度對(duì)砷信號(hào)值有著重要的影響，配制體積分?jǐn)?shù)不同的9種鹽酸溶液(1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%，7.0%，8.0%，9.0%)，對(duì) 50 μg/L砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，不同鹽酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的砷熒光信號(hào)值見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)小于5%時(shí)，隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的增大，砷的熒光信號(hào)值逐漸增大；當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，砷的熒光信號(hào)值達(dá)到最大；當(dāng)鹽酸體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，砷的熒光信號(hào)值略有下降，考慮到試劑成本和環(huán)保因素，選擇載流鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5.0%。

圖3 不同鹽酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的砷信號(hào)值

2.2.4 硼氫化鉀濃度

配制9種不同質(zhì)量濃度的硼氫化鉀溶液(4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L)，對(duì) 50 μg/L 砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，不同硼氫化鉀質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的砷熒光信號(hào)值見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度小于20 g/L時(shí)，隨著硼氫化鉀質(zhì)量濃度的增加，砷的信號(hào)值增大；當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，砷的信號(hào)值達(dá)到最大；而當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時(shí)，砷的熒光信號(hào)值基本保持穩(wěn)定，考慮到試劑成本和環(huán)保因素，選擇硼氫化鉀的質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖4 不同硼氫化鉀濃度對(duì)應(yīng)的砷信號(hào)值

2.3 色譜圖

在1.4儀器工作條件下對(duì)50 μg/L的砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)試，色譜圖見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，在8 min之內(nèi)，亞砷酸鹽、二甲基砷酸、一甲基砷酸、砷酸鹽依次出峰，實(shí)現(xiàn)了完全分離，其保留時(shí)間分別為 2.703，3.393，4.29，6.882 min。

圖5 砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.4 線性范圍及檢出限

在1.4儀器工作條件下，對(duì)1.2中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測(cè)定。以熒光強(qiáng)度(Y)為縱坐標(biāo)，以砷形態(tài)的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到4種砷形態(tài)的線性方程。對(duì)試劑空白測(cè)定20次，以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值的3倍計(jì)算4種砷形態(tài)的檢出限。線性方程、線性范圍和檢出限見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及檢出限

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)

以鯽魚(yú)樣品為研究對(duì)象，向樣品中分別加入3種不同水平 (0.1，1.0，10.0 μg/L)的無(wú)機(jī)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)1 μg/L的色譜圖見(jiàn)圖6，加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

圖6 加標(biāo)樣品色譜圖

表2 精密度及回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6) %

由表2可知，4種砷形態(tài)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～4.81%(n=6)，加標(biāo)回收率為88.4%～101.7%可見(jiàn)本方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

2.6 樣品測(cè)定

用本方法對(duì)市售魚(yú)、蝦、蟹和貝類(lèi)4種水產(chǎn)品樣品中的4種砷形態(tài)含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，10份被測(cè)樣品中亞砷酸鹽含量在5.1～33.9 μg/kg之間，砷酸鹽含量在3.2～23.8 μg/kg之間，一甲基砷酸、二甲基砷酸的含量分別為 0～4.2 μg/kg，0～5.5 μg/kg，相對(duì)較低。無(wú)機(jī)砷(亞砷酸鹽與砷酸鹽之和)含量在9.4～57.7 μg/kg范圍內(nèi)。

GB 2762–2012規(guī)定魚(yú)類(lèi)及其制品中無(wú)機(jī)砷的限量值為100 μg/kg，其它水產(chǎn)動(dòng)物及其制品的無(wú)機(jī)砷的限量值為 500 μg/kg［12］?？梢?jiàn)此次所檢測(cè)的10份樣品中無(wú)機(jī)砷［As(Ⅲ）與As(Ⅴ)之和］的含量均在限量值以內(nèi)。

表3 水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)的測(cè)定結(jié)果 μg/kg

3 結(jié)語(yǔ)

建立了高效液相色譜–原子熒光光譜法測(cè)定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)，該方法樣品前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，回收率穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，雜質(zhì)干擾少，檢測(cè)成本較低，適用于各類(lèi)水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)的測(cè)定。

［1］吳燁飛，潘友浩，李榮茂.高效液相色譜–氫化物–原子熒光聯(lián)用技術(shù)測(cè)定海藻中無(wú)機(jī)砷［J］.福建水產(chǎn)，2014，36(2): 125–131.

［2］吳思霖，于建，王欣美，等.高效液相色譜–原子熒光聯(lián)用技術(shù)測(cè)定水產(chǎn)品中無(wú)機(jī)砷［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7(7):2 658–2 662.

［3］林燕奎，王丙濤，顏治，等.食用菌中的總砷和砷形態(tài)分布研究［J］.食品科技，2012(5): 295–299.

［4］王亞，張春華，葛瀅. 高效液相色譜–氫化物發(fā)生–原子熒光光譜法檢測(cè)紫菜中的砷形態(tài)［J］.分析試驗(yàn)室，2013(5): 34–38.

［5］黃亞濤，毛雪飛，楊慧，等.高效液相色譜原子熒光聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大米中無(wú)機(jī)砷［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40(12): 117–121.

［6］張強(qiáng)，富景奇，徐苑苑，等.地下水中無(wú)機(jī)砷的高效液相色譜–氫化物發(fā)生–原子熒光測(cè)定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2009，26(12): 1 067–1 068.

［7］魏茂瓊，劉宏程，嚴(yán)紅梅，等.液相色譜–原子熒光法測(cè)定大米中 4種砷形態(tài)［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7(9):3 673–3 677.

［8］田雨，蔡璇，鄭錫波，等.高效液相色譜–氫化物發(fā)生–原子熒光光譜法分析桂皮中砷形態(tài)化合物的檢測(cè)方法［J］.化學(xué)工程師，2014，28(2): 19–21.

［9］湯鏨，馬冰潔，應(yīng)英，等.原子熒光形態(tài)分析儀測(cè)定植物類(lèi)海產(chǎn)品中砷形態(tài)化合物［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010(11): 2 729–2 731.

［10］黃東仁.福建省紫菜中砷的形態(tài)及含量［J］.中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2015，5(1): 52–60.

［11］GB 5009.11–2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定［S］.

［12］GB 2762–2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量［S］.

Determination of 4 Arsenic Species in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography–Atomic Fluorescence Spectrometry

Xia Yongjun
(Zhangjiagang Entry–Exit Inspection & Quarantine Bureau of P.R.C, Zhangjiagang 215600, China)

A method for determination of four arsenic species ［As(Ⅲ), As(Ⅴ), MMA, DMA］in aquatic products by high performance liquid chromatography–atomic fluorescence spectrometry was developed. The experiment conditions were optimized. The negative high voltagewhich was 270 V, lamp current was 80 mA, the atomic height was 10 mm,the concentration of potassium borohydride was 20 g/L (with 5 g/L KOH), and carrying current was 5% hydrochloric acid. The linear range of the method was 0–100 μg/L, the correlation coefficients were more than 0.999. The detection limits of various arsenic species were 0.20–0.45 μg/L. The relative standard deviations of detection results were 1.98%–4.81%(n=6), and the addion recovery rates were 88.4%–101.7%. The method is rapid, accurate and sensitive, it is suitable for the determination of arsenic species in aquatic products.

aquatic products; arsenic speciation; liquid chromatography atomic fluorescence spectrometry

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0046–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.012

聯(lián)系人：夏擁軍；E-mail: hixiayongjun@163.com

2017–06–26