魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)關(guān)中黑豬精液常溫保存效果研究

魏 寧，候震坤，謝景興，劉兆軍，楊公社，龐衛(wèi)軍*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

欄目協(xié)辦

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)在常溫保存的關(guān)中黑豬精液中添加ε-聚賴(lài)氨酸效果的研究，探究新的減少稀釋液中抗生素使用的可能性。向稀釋后的精液中分別添加0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/L的ε-聚賴(lài)氨酸，檢測(cè)其保存1～5 d的精液質(zhì)量。結(jié)果表明：ε-聚賴(lài)氨酸在濃度為0.04～0.64 g/L不會(huì)影響精液滲透壓，添加ε-聚賴(lài)氨酸可以提高關(guān)中黑豬精液的保存效果，其中最適濃度為0.16 g/L。

ε-聚賴(lài)氨酸；公豬精液；常溫保存

由于采精不可能在無(wú)菌條件下操作，精液不可避免地會(huì)受到來(lái)自周?chē)h(huán)境如空氣、糞便、尿液等中細(xì)菌的污染，故能從精液中檢測(cè)出細(xì)菌。相關(guān)研究表明，污染精液的細(xì)菌主要是革蘭氏陰性菌，其中以腸桿菌科菌為主，且精液中細(xì)菌的濃度一般為104～105cfu/mL[1]。精液中的細(xì)菌會(huì)降低精子的品質(zhì)，影響母豬的繁殖成績(jī)[2]。

目前，主要通過(guò)在稀釋液中添加抗生素來(lái)抑制精液中的細(xì)菌生長(zhǎng)。然而，由于近年來(lái)抗生素在畜牧業(yè)中的濫用導(dǎo)致許多抗藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，使得添加在稀釋液中的抗生素效果大大降低。一份報(bào)告表明，某公豬站中的公豬精液由于受到對(duì)慶大霉素具有耐藥性的粘質(zhì)沙雷氏菌污染，精液在常溫保存36～48 h后發(fā)生大量的凝集，精子的運(yùn)動(dòng)能力顯著降低[3]。若繼續(xù)在精液中添加常規(guī)抗生素，則可能會(huì)使精液中耐藥性細(xì)菌定向感染母豬。因此，尋找新的抗菌物質(zhì)完全替代或部分替代傳統(tǒng)抗生素是解決這一問(wèn)題的主要方法之一。

ε-聚賴(lài)氨酸（ε-PL）是一種天然的陽(yáng)離子抗菌肽，ε-PL的特點(diǎn)是對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在高溫下仍然具有抗菌活性，易溶于水[4]，故ε-PL對(duì)于環(huán)境幾乎不會(huì)造成任何影響[5]。由于ε-PL具有安全無(wú)害，抗菌廣譜和可被生物降解等特點(diǎn)。目前該物質(zhì)已經(jīng)被廣泛用于食品、工業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域。在美國(guó)和日本，已允許在食品中添加ε-PL。本實(shí)驗(yàn)室過(guò)去通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)已知ε-聚賴(lài)氨酸擁有一定的抑菌能力，并可以替代一定量的抗生素。本試驗(yàn)在關(guān)中黑豬精液中添加不同濃度ε-PL，探究其對(duì)關(guān)中黑豬精液的影響，為其在關(guān)中黑豬精液常溫保存的使用提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 關(guān)中黑豬精液精液來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧生產(chǎn)實(shí)踐基地成年健康關(guān)中黑豬公豬。使用BTS液進(jìn)行稀釋?zhuān)囼?yàn)組分別添加 0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/Lε-聚賴(lài)氨酸，放入17℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA），羅丹明(Rh123)，碘化丙啶(PI)。

1.1.3 儀器

CASA（計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀），滲透壓測(cè)定儀，無(wú)菌操作臺(tái)，17℃恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，37℃恒溫水浴鍋等。

1.2 方法

1.2.1 精液滲透壓的測(cè)定

使用滲透壓測(cè)定儀進(jìn)行滲透壓檢測(cè)。

1.2.2 不同時(shí)間段中精液中菌落數(shù)的測(cè)定

根據(jù)常溫保存的時(shí)間段，將精液用無(wú)菌水稀釋至合理的倍數(shù)。取100 μL稀釋后的精液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基表面，而后倒置放37℃恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)12 h。計(jì)數(shù)不同稀釋倍數(shù)下培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)（每個(gè)平板上以30～300個(gè)菌落為宜），乘以相應(yīng)的倍數(shù)即為對(duì)應(yīng)精液中細(xì)菌的個(gè)數(shù)。

1.2.3 精子活率的測(cè)定

取出關(guān)中黑豬精液，將精液輕輕搖勻，取200 μL公豬精液置于1.5 mL的離心管中，放37℃水浴鍋中孵育4 min，并將蓋玻片和載玻片放37℃恒溫載物臺(tái)上預(yù)熱。使用精子計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)（CASA）檢測(cè)精子活率。分別記下3個(gè)視野下精子的活率，取其平均值。

1.2.4 精子質(zhì)膜完整性的測(cè)定

按檸檬酸鈉7.35 g/L，果糖13.5 g/L配制檸檬酸鈉-果糖低滲液（現(xiàn)配現(xiàn)用），待溶液溶解后，從各試驗(yàn)組中吸取1 mL精液，分別加入9 mL檸檬酸鈉—果糖低滲液，在37 ℃條件下水浴30 min，期間不時(shí)輕晃試管，以免精子沉積。完畢后，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察精子彎尾率。計(jì)算在200個(gè)精子中尾部彎曲的精子所占比例，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 精子頂體完整性的測(cè)定

使用熒光染料異硫氰酸熒光素-花生凝集素（FITC-PNA）對(duì)精子進(jìn)行染色檢測(cè)頂體完整率。取30 μL精液均勻涂抹于干凈的載玻片上，自然風(fēng)干。風(fēng)干后的樣品玻片置于無(wú)水甲醇中，固定10 min后放置于空氣中，自然風(fēng)干。取30 μL FITC-PNA工作液，均勻覆蓋樣品，再將玻片置于濕盒內(nèi)，37℃，避光孵育30min。孵育結(jié)束后使用PBS沖洗玻片2～3次，洗去浮色，后迅速在熒光顯微鏡下觀察拍照，使用450～490 nm紫外光激發(fā)。選擇5個(gè)以上清晰的視野，且每個(gè)視野精子數(shù)200個(gè)以上，計(jì)算頂體完整精子比例。試驗(yàn)全程避光操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，利用 SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），最終以Mean±SD形式表現(xiàn)。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL對(duì)稀釋液滲透壓的影響

由表1可知ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)精液的滲透壓影響很小。ε-PL添加量在0.04～0.64 g/L以及0.25 g/L慶大霉素時(shí)對(duì)于精液的滲透壓影響不大（P＞0.05），當(dāng)該物質(zhì)添加至1.28 g/L時(shí)，精液中的滲透壓顯著高于其他組（P＜0.05）。

表1 不同濃度ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)精液滲透壓的影響

2.2 ε-PL對(duì)精液中菌落數(shù)的影響

由圖1可知，在稀釋液中添加0.04～1.28 g/L的ε-聚賴(lài)氨酸在常溫1～3 d內(nèi)能有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。當(dāng)保存至第3天，0.04 g/L與0.16 g/L組內(nèi)的細(xì)菌開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，但這兩組的菌落數(shù)量仍然低于空白對(duì)照組，說(shuō)明在此濃度下ε-聚賴(lài)氨酸仍然具有抑菌效果；隨著保存時(shí)間的增加，ε-聚賴(lài)氨酸的抑菌能力降低；而0.64 g/L，1.28 g/L處理組在1～5d內(nèi)均保持強(qiáng)抑菌效果。

2.3 ε-PL對(duì)精子活率的影響

如表2所示常溫保存第1天后各處理組與對(duì)照組的精子活率差異不明顯（P＞0.05)。當(dāng)保存至第2天時(shí)對(duì)照組和添加0.08 g/L ε-PL處理組的活率顯著高于其他組（P＜0.05）。隨著保存時(shí)間增加，當(dāng)保存至第3天時(shí)0.04 g/L，0.08 g/L，0.16 g/L ε-PL的處理組顯著高于其他組（P＜0.05）。而其他處理組精子的活力均高于對(duì)照組。當(dāng)保存至第4、5天時(shí)0.16 g/L ε-PL處理組的保存效果最好。此外，各處理組的精子活力均高于對(duì)照組。因此，相比于其他處理組添加0.16 g/L ε-PL常溫保存5 d后精子活率最高。

圖1 不同濃度ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)精液中菌落數(shù)的影響

表2 不同濃度ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)精子活率的影響

2.4 ε-PL對(duì)精子質(zhì)膜完整性影響

如表3所示常溫保存兩天后，添加0.64 g/L、1.28 g/L ε-PL處理組的質(zhì)膜完整性顯著低于其他組（P＜0.05）。當(dāng)保存至第3天時(shí)，0.16 g/L ε-PL處理組的精子質(zhì)膜完整性最高。各處理組的質(zhì)膜完整性高于對(duì)照組。而當(dāng)保存至第5天時(shí)，各處理組的質(zhì)膜完整性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05)。相對(duì)于其他處理組，0.16 g/L ε-PL的處理組質(zhì)膜完整率最高。

2.5 ε-PL對(duì)精子頂體完整性影響

關(guān)中黑公豬精液在常溫保存第1、2天，公豬精子的頂體完整性差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)保存至第3天時(shí)，各處理組中的精子頂體完整性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而處理組間添加0.16 g/L ε-PL的處理組精子頂體完整性最高。在第4天時(shí)，各處理組的精子頂體完整性仍顯著高于對(duì)照組，其中0.04g/L、0.08 g/L、0.16 g/L3個(gè)處理組精子頂體完整性相近（P＞0.05），且高于其他處理組（P＜0.05）。第 5天時(shí)0.16 g/L ε-PL的處理組頂體完整性最高。

表3 不同濃度ε-PL對(duì)精子質(zhì)膜完整性影響

表4 不同濃度ε-PL對(duì)精子頂體完整性影響

3 討論

稀釋液的穩(wěn)定滲透壓為保證精子在液態(tài)常溫保存，而精子的耐受滲透壓為240～380 mosm之間，過(guò)低的滲透壓會(huì)影響精子質(zhì)膜的完整性[6-7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在使用BTS稀釋后的關(guān)中黑豬精液中添加0.04～0.64 g/L ε-PL后，其滲透壓基本不變，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)于滲透壓的影響較小。

ε-PL是一種由賴(lài)氨酸殘基構(gòu)成的陽(yáng)離子抗菌肽，其表面帶有大量的正電荷，能黏附到帶有大量負(fù)電荷的菌體膜上，使菌體膜表面成孔洞狀以影響細(xì)菌的正常生命活動(dòng)，從而起到抑菌的作用[8]，其對(duì)于G+和G-均具有不錯(cuò)的抑制效果[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)精液中ε-PL添加量為0.04 g/L時(shí)，在0～3 d能有效抑制精液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，但隨著保存時(shí)間的增加抑制效果逐漸降低。當(dāng)保存時(shí)間在3～5 d時(shí)，0.16 g/L處理組精液中細(xì)菌含量接近于空白對(duì)照組中第2天的細(xì)菌數(shù)量。因此，在0.16 g/L時(shí)就已經(jīng)能夠?qū)⒐i精液中的細(xì)菌量控制在安全范圍內(nèi)（不損傷精子）。但當(dāng)精液常溫保存超過(guò)5 d，添加0.16 g/L ε-PL對(duì)精液中細(xì)菌控制效果可能會(huì)大大降低。

精子活率是評(píng)價(jià)精子運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo)之一，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用精子活率低于60%的精液輸精，會(huì)降低母豬的繁殖成績(jī)[10]。精子活率是評(píng)價(jià)常溫保存后精子受精能力的重要指標(biāo)[11]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)精液常溫保存至第2天時(shí)，對(duì)照組中的精子活率高于其他處理組，一方面可能是因?yàn)棣?PL對(duì)精子有輕微的毒害作用，另一方面是由于常溫保存至第2天精液中存在細(xì)菌還不足以影響到精子的運(yùn)動(dòng)。

精子質(zhì)膜和頂體是否完整是精子能否發(fā)揮其正常生理功能的保證。2004年曾發(fā)現(xiàn)與用傳統(tǒng)的精子活率估計(jì)母豬繁殖成績(jī)相比，精子質(zhì)膜和頂體完整性能更準(zhǔn)確地評(píng)估輸精后母豬的繁殖成績(jī)[11]。精子的受精能力不僅與質(zhì)膜完整性有關(guān)還與頂體完整性相關(guān)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在常溫保存第1天各組間的質(zhì)膜和頂體完整性差異不顯著。當(dāng)保存至第2天時(shí)高濃度ε-PL處理組（0.64 g/L，1.28 g/L），精子質(zhì)膜完整性顯著低于低濃度及對(duì)照組。這是由于ε-PL對(duì)于精子可能具有輕微的毒性作用。由于公豬精子與其他哺乳動(dòng)物精子相比，質(zhì)膜中的膽固醇含量較低，因此，陽(yáng)離子抗菌肽可能會(huì)結(jié)合到豬精子膜表面輕微的影響精子質(zhì)膜和完整性，而公豬精子的頂體幾乎未受到影響?？傊?，精液中的細(xì)菌不利于精子的常溫保存，其會(huì)損傷精子的質(zhì)膜和提前引發(fā)精子的頂體反應(yīng)。而對(duì)照組的質(zhì)膜和頂體完整性在常溫保存第3天后顯著低于處理組，是因?yàn)榧?xì)菌在第2天開(kāi)始大量的繁殖，保存至第3天對(duì)照組中的細(xì)菌數(shù)量已威脅精子存活。當(dāng)保存至第4、5天時(shí)，各處理組的質(zhì)膜和頂體完整性均高于對(duì)照組，而在0.04 g/L處精子仍能夠保持較高的頂體完整性，仍可能是由于ε-聚賴(lài)氨酸減少了細(xì)菌對(duì)精子的黏附作用[12]。

4 結(jié)論

0.04～0 .64 g/Lε-PL不影響稀釋精液的滲透壓，但能有效控制精液中細(xì)菌的生長(zhǎng)，提高關(guān)中黑豬精液的保存效果，其中ε-PL的最佳濃度為0.16 g/L。

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2017-08-04）

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）和西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站（基地）科技成果推廣項(xiàng)目（TGZX2015-18）

魏寧(1993-)，男，在讀碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wein0513@163.com通訊作者：龐衛(wèi)軍(1972-)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：肌肉生物學(xué)與豬遺傳改良，E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn