佟海英，范盎然，李 婧，烏吉斯古冷，張 月，張少乾，于 雪，呼日樂(lè)巴根，陳潮光

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；4 內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特 010020)

蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎毒性的影響

佟海英1，范盎然2，李 婧3，烏吉斯古冷4，張 月2，張少乾2，于 雪2，呼日樂(lè)巴根3，陳潮光2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110；4 內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特 010020)

為觀察檳榔十三味丸(高尤-13)對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎毒性的影響，隨機(jī)將48只Wistar雄性大鼠根據(jù)蔗糖水消耗量分為6組：檳榔十三味丸低、中、高劑量組(0.25，0.5，1.0 g·kg-1)，氟西汀組(3.3 mg·kg-1)，模型組和正常對(duì)照組，每組8只. 除正常對(duì)照組外，其余大鼠均采用慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法制備抑郁模型，造模同時(shí)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥28 d后，檢測(cè)大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)含量，HE染色法觀察肝腎組織形態(tài)學(xué)變化.結(jié)果顯示：模型組大鼠較正常對(duì)照組血清ALT含量顯著升高(P<0.01)，肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清(P<0.05).檳榔十三味丸低、中、高劑量組較模型組血清ALT含量顯著降低(P<0.01或P<0.05),給藥各組與氟西汀組大鼠的肝臟未見(jiàn)與藥物相關(guān)的毒性病變(P>0.05).各組大鼠血清AST、UREA、CREA含量無(wú)顯著差異，腎臟病理變化不顯著(P>0.05).說(shuō)明檳榔十三味丸對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠無(wú)肝腎毒性，并具有肝損傷修復(fù)作用.

檳榔十三味丸；抑郁癥；肝腎功能；肝腎病理變化

AbstractIn order to observe the effects of Betel Shisanwei ingredients pill (Gao-You-13) on the liver and kidney toxicity of chronic stress depression model rats,48 male Wistar rats were randomly divided into six groups according to the sugar consumption test (8 rats in each group): low，medium and high dose group (0.25,0.5,1.0 g·kg-1) of Gao-You-13 group,fluoxetine group (3.3 mg·kg-1),model group and normal control. Each group was treated with the chronic unpredictable mild stress stimulation under separation except the normal control group. Meanwhile,the rats were given the drugs once daily for 28 days. Then the contents of ALT,AST,UREA and CREA in rats′ serum were tested. The liver and kidney tissue morphological changes were observed by HE staining. The results showed that compared with the normal control,ALT levels in model group increased significantly (P<0.01) and most liver cells appeared mild swelling and degeneration,hepatic sinus narrowed,cell boundaries were unclear(P<0.05); while ALT levels in Gao-You-13 group decreased significantly compared with the model group (P<0.01 orP<0.05). Drug related toxicity lesions did not appear in Gao-You-13 and fluoxetine treatment group (P>0.05). AST,UREA,CREA contents and kidney pathological changes did not show significant differences in each group (P>0.05). It was confirmed that Gao-You-13 could repair liver damages without liver and kidney toxicity for the chronic stress depression model rats.

KeywordsBetel Shisanwei ingredients pill; depression; hepatorenal function; liver and kidney pathological changes

檳榔十三味丸(高尤-13)源自19世紀(jì)蒙醫(yī)方劑學(xué)經(jīng)典著作《蒙醫(yī)金匱》(又名方海)，由檳榔、肉豆蔻、沉香、當(dāng)歸、木香、草烏(制)、蓽茇、紫硇砂、葶藶子、丁香、廣棗、干姜、胡椒等13味藥組成[1].本方能夠調(diào)節(jié)赫依、安神止痛，用于心悸、失眠、精神失常、游走刺痛等癥[2].目前臨床常用檳榔十三味丸治療抑郁癥，療效甚佳[3].本課題組發(fā)現(xiàn)該方在小鼠強(qiáng)迫游泳、懸尾、利血平拮抗抑郁模型實(shí)驗(yàn)中，具有確切的抗抑郁作用[4].檳榔十三味丸對(duì)慢性應(yīng)激致抑郁模型大鼠行為學(xué)、海馬和額葉皮層5-HT、NE、DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，以及下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和AC-cAMP-PKA信號(hào)通路也具有顯著的改善作用[5-7].通過(guò)上述研究，明確了該方治療抑郁癥的確切療效以及部分機(jī)制.但檳榔十三味丸中含有毒性藥材草烏(制)以及礦物藥紫硇砂，在臨床長(zhǎng)期應(yīng)用后是否產(chǎn)生肝腎毒性等尚不清楚.故本文觀察了檳榔十三味丸對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠肝腎功能以及肝腎組織形態(tài)學(xué)的影響，初步探討該方的肝腎毒性，為臨床長(zhǎng)期安全用藥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1材料和儀器

檳榔十三味丸[檳榔60 g，沉香120 g，肉豆蔻60 g，丁香48 g，木香36 g，廣棗60 g，草烏(制)60 g，干姜42 g，蓽撥42 g，胡椒42 g，紫硇砂30 g，當(dāng)歸60 g，葶藶子60 g，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司,批號(hào)120805，國(guó)藥準(zhǔn)字Z15020412]；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑，批號(hào)20120330)；鹽酸氟西汀分散片(Patheon France，批號(hào)2076A)；蔗糖(北京化工廠，批號(hào)20110303).肌酐(CREA)測(cè)定試劑盒、尿素(UREA)測(cè)定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(中生北控生物科技).

48只180～200 g清潔級(jí)Wistar雄性大鼠[北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2011-0004]，SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室溫20～22 ℃(除冷熱刺激)自由攝食和飲水(除造模過(guò)程中禁食禁水)，60%～70%相對(duì)濕度.12 h光照周期，7∶00～19∶00光照，19∶00～7∶00黑暗(晝夜顛倒刺激除外).

半自動(dòng)生化分析儀(Microlab300，荷蘭威圖科學(xué)公司)，1/10萬(wàn)電子天平(ES125SM，瑞士precisa)，電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)，離心機(jī)(Sigma公司).

1.2分組和給藥

Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后禁水24 h，給予1%蔗糖水，測(cè)1 h內(nèi)的消耗量，依據(jù)蔗糖水消耗量隨機(jī)分為6組：檳榔十三味丸低、中、高劑量(0.25,0.5,1.0 g·kg-1·d-1)組、氟西汀組(3.3 mg·kg-1·d-1)、模型組和正常對(duì)照組(灌胃0.5% CMC-Na)，每組8只.除正常對(duì)照組每籠4只外其他各組孤養(yǎng)，按10 mL·kg-1連續(xù)給藥28 d.

1.3制備模型

參照文獻(xiàn)[8-10]并改良建立慢性輕度不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)模型，除正常對(duì)照組外各組大鼠共接受刺激28 d，包括禁食禁水24 h，晝夜顛倒24 h，4 ℃冰水游泳5 min ，45 ℃熱環(huán)境5 min，夾尾1 min，電擊足底(電壓36 V，1 min刺激1次，每次10 s，共30次).

1.4肝腎功能檢測(cè)

禁食禁水24 h后處死大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血8～10 mL，室溫下放置1 h后，4℃ 3000 r·min-1離心10 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清ALT、AST、UREA和CREA含量.

1.5肝腎組織形態(tài)學(xué)

取大鼠同一部位肝組織和同側(cè)的腎組織，福爾馬林固定后用石蠟包埋，切片4 μm再HE染色，光鏡下觀察肝腎組織病理變化.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，單因素方差分析法進(jìn)行組間比較，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較肝腎組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)組間差異，P<0.05有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1檳榔十三味丸對(duì)大鼠肝腎功能的影響

檳榔十三味丸對(duì)大鼠肝腎功能的影響結(jié)果見(jiàn)表1.由表1可知：應(yīng)激處理后第28 d，模型組大鼠血清ALT含量較正常組顯著升高(P<0.01)；檳榔十三味丸低、中、高劑量組血清ALT含量較模型組顯著降低(P<0.01和P<0.05)；各組大鼠血清AST、CREA、UREA含量無(wú)顯著差異(P>0.05).

表1 檳榔十三味丸對(duì)大鼠肝腎功能相關(guān)生化指標(biāo)變化的影響

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.2檳榔十三味丸對(duì)大鼠肝腎組織形態(tài)學(xué)的影響

檳榔十三味丸對(duì)大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可見(jiàn)，正常對(duì)照組除個(gè)別動(dòng)物(4號(hào)動(dòng)物)匯管區(qū)多發(fā)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，均未見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹、變性和壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀圍繞中央靜脈排列，間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織結(jié)構(gòu)正常；模型組大部分動(dòng)物(7/8只)的肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清，個(gè)別動(dòng)物(1/8只)肝組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病變，較正常組有顯著性差異(P=0.019<0.05)；氟西汀以及檳榔十三味丸給藥各組的肝臟未見(jiàn)與藥物相關(guān)的毒性病變(P>0.05).

a) 正常對(duì)照組; b) 模型組; c) 氟西汀組; d～f) 檳榔十三味丸低、中、高劑量組圖1 各組大鼠肝臟組織病理結(jié)果(HE×200)Fig.1 Pathological results of rat liver tissue in each group (HE×200)

檳榔十三味丸對(duì)大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可見(jiàn)，正常對(duì)照組動(dòng)物腎小球和腎小管未見(jiàn)明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常；模型組動(dòng)物除個(gè)別動(dòng)物(8號(hào)動(dòng)物)腎間質(zhì)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，其余動(dòng)物腎小球、腎小管未見(jiàn)明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常(P>0.05)；氟西汀以及檳榔十三味丸給藥各組的腎組織未見(jiàn)明顯病變(P>0.05).

a) 正常對(duì)照組; b) 模型組; c) 氟西汀組; d～f) 檳榔十三味丸低、中、高劑量組圖2 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)果(HE×200)Fig.2 Pathological results of rat renal tissue in each group (HE×200)

3 討論

目前廣泛應(yīng)用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠抑郁模型，研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥物作用機(jī)制[11].文中實(shí)驗(yàn)大鼠通過(guò)敞箱、蔗糖水消耗等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，基本模擬了抑郁癥的臨床表現(xiàn)，造模成功，給予藥物檳榔十三味丸和氟西汀治療有效地改善了其抑郁癥狀[12].本文重點(diǎn)關(guān)注該方的肝腎毒性，以ALT、AST、UREA、CREA 4個(gè)反映肝腎功能的生化指標(biāo)為毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)，并結(jié)合組織形態(tài)學(xué)觀察.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組大鼠血清ALT含量較正常組顯著升高，給予檳榔十三味丸后，各劑量組ALT較模型組顯著降低，其余指標(biāo)無(wú)顯著差異.

ALT、AST是臨床上常用來(lái)反映肝功能的酶學(xué)指標(biāo)，是檢測(cè)肝功能受損的首選指標(biāo).ALT主要存在于肝細(xì)胞漿，1%的肝細(xì)胞壞死能使血清中ALT活力增加1倍[13].AST在肝細(xì)胞漿內(nèi)僅占20%，其余80%存在于線粒體中，當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重病變、壞死時(shí)，線粒體內(nèi)AST便釋放出來(lái)[14].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組大鼠血清中ALT的含量顯著升高，同時(shí)肝組織形態(tài)學(xué)顯示，其大部分動(dòng)物(7/8只)的肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清.因此CUMS結(jié)合孤養(yǎng)誘導(dǎo)的抑郁模型能損害大鼠的肝臟功能，在28 d模型中，尤其對(duì)ALT的影響更顯著.王國(guó)力等[15]經(jīng)CUMS造模28 d后，大鼠血清ALT、AST含量顯著升高，肝組織切片HE染色顯示，大鼠中央靜脈擴(kuò)張，肝細(xì)胞中度水腫，肝細(xì)胞體積明顯增大，局部胞漿內(nèi)可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，肝血竇受壓明顯變窄，匯管區(qū)血管擴(kuò)張明顯，中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織増生.本實(shí)驗(yàn)中，僅ALT顯著升高，AST和肝組織病理學(xué)變化不顯著，由于AST在肝臟發(fā)生嚴(yán)重破壞或壞死時(shí)會(huì)顯著升高，故本結(jié)果的不同與大鼠種類、造模方法、刺激強(qiáng)度、檢測(cè)方法等有關(guān).經(jīng)檳榔十三味丸干預(yù)后，ALT含量下降，組織形態(tài)學(xué)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)肝功能的修復(fù)作用，與本方中肉豆蔻[16]、當(dāng)歸[17]、蓽茇[18]、干姜[19]、胡椒[20]等的保肝作用以及木香[21]的利膽作用有關(guān)，充分體現(xiàn)了經(jīng)典名方安全有效的合理性，值得深入研究.陽(yáng)性藥氟西汀對(duì)大鼠的肝功能未產(chǎn)生顯著影響.

CREA和UREA是常用的腎功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CUMS結(jié)合孤養(yǎng)誘導(dǎo)的抑郁模型對(duì)大鼠腎功能無(wú)顯著影響，模型組動(dòng)物除個(gè)別動(dòng)物腎間質(zhì)灶狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，其余動(dòng)物腎小球、腎小管未見(jiàn)明顯病變，組織結(jié)構(gòu)正常.經(jīng)檳榔十三味丸干預(yù)后，大鼠腎功能和組織形態(tài)學(xué)未見(jiàn)顯著變化.說(shuō)明檳榔十三味丸對(duì)抑郁模型大鼠腎功能無(wú)顯著的毒性作用.

綜上，大鼠經(jīng)CUMS結(jié)合孤養(yǎng)建立抑郁模型后，大鼠血清ALT含量顯著升高，肝細(xì)胞輕度腫脹、變性，肝竇縮窄，細(xì)胞界限不清.檳榔十三味丸能降低ALT的升高，對(duì)腎臟無(wú)顯著影響，亦無(wú)肝腎毒性，并具有肝損傷修復(fù)作用，故為該復(fù)方的臨床長(zhǎng)期安全應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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EffectofMongolianBetelShisanweiIngredientsPill(Gao-You-13)onLiverandKidneyToxicityofChronicStressDepressionModelRats

TongHaiying1,FanAngran2,LiJing3,Wujisiguleng4,ZhangYue2,ZhangShaoqian2,YuXue2,Hurilebagen3,ChenChaoguang2

(1 Institute of Ethnic Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2 School of Basic Medical Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3 College of Mongolian Medicine and Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010110,China;4 Inner Mongolia International Mongolian Medicine Hospital,Hohhot 010020,China)

Q956; R965.3

A

1672-4321(2017)03-0057-04

2016-12-20

佟海英(1976-)，女，主任醫(yī)師，副研究員，博士，研究方向：蒙藥基本理論與臨床應(yīng)用，E-mail：haiyingtong@sohu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202998)