劉文靜 張志旭 秦 丹

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128)

破壁方式對蜂花粉抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響

劉文靜1張志旭2秦 丹3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2. 國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術(shù)實驗室，湖南 長沙 410128；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南 長沙 410128)

以不同破壁方式處理過的油菜蜂花粉為研究對象，提取水溶活性成分，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)作為底物，對蜂花粉作為天然α-葡萄糖苷酶活性抑制劑的功效進行了評價。結(jié)果表明：破壁方式對蜂花粉功能活性成分以及功效評價結(jié)果影響顯著，溫差破壁、超臨界二氧化碳破壁、超聲輔助酶解破壁及對照組對α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為(13.73±1.15)%，(-8.07±0.93)%，(16.70±0.87)%,(9.68±0.89)%；油菜蜂花粉多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率在(3.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%，無明顯線性關(guān)系；破壁后的樣品多糖含量顯著增加，但油菜蜂花粉多糖對α-葡萄糖苷酶活性無作用，可能與黃酮等其它成分相關(guān)。

蜂花粉；α-葡萄糖苷酶；破壁方式；降血糖；多糖

Abstract： The wall of rape bee pollens were broken by using different methods, and them the water-soluble ingredients were extracted. Therefore, the 4-Nitrophenylα-D-glucopyranoside (PNPG) was as substrate to evaluate the efficiency of bee pollen as a natural alpha glucosidase inhibitor. The results showed that the wall-breaking manners had significant effect on the active ingredient. The inhibition rate of thealphaglucosidase was found ordered as following, temperature difference (13.73±1.15)%, supercritical CO2(-8.07±0.93)%, ultrasonic assisted enzymatic (16.70±0.87)%,and untreated (9.68±0.89)%. Moreover, the inhibition rate of rape pollen polysaccharide on alpha glucosidase activity was fluctuated at (2.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%, and there was no obvious linear relationship. Finally, after the walls were broken, the content of polysaccharides increased significantly, but rape pollen polysaccharide had no effect on alpha glucosidase activity. This might be related to flavonoids or other components.

Keywords： rapebee pollen; alpha glucosidase; wall-breaking manner; decrease blood glucose; polysaccharide

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，現(xiàn)已在世界范圍內(nèi)嚴重威脅到人們的生命健康[1]?？崭寡腔虿秃笱蔷S持在較高的水平是糖尿病前期的主要癥狀，也是導致糖尿病并發(fā)癥的重要因素。目前主要使用α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物作為降低餐后血糖、治療糖尿病的一線藥物[2-4]，主要包括：拜糖平(阿卡波糖)和米格列醇等。但這些藥物具有一定的副作用，會造成腸道系統(tǒng)紊亂等免疫疾病[5]。α-葡萄糖苷酶是一類能夠催化水解α-葡萄糖基的酶的總稱，分布廣泛，在人體內(nèi)可將飲食中的碳水化合物水解為單糖供人體吸收，是引起餐后血糖增加的重要酶類。因此，隨著糖尿病患者和潛在患者在全球范圍內(nèi)急劇增加，直接從日常飲食中尋找天然高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點。

蜂花粉是一種兼具食用與藥用價值的食品，富含營養(yǎng)物質(zhì)同時又有多種生理活性功能如增強免疫力、抗氧化、抗輻射、降血脂等[6-7]。近年來也有研究[8-9]報道了蜂花粉提取物具有降血糖的功效。蜂花粉細胞壁堅硬，壁上存在萌發(fā)孔，可與外界聯(lián)通，但通常為閉鎖狀態(tài)，使得花粉細胞內(nèi)溶物難以溶出[10]。因此體外對蜂花粉進行功效評價，必須進行破壁處理，以釋放花粉的活性成分。破壁前后花粉品質(zhì)以及功能活性物質(zhì)會有所改變，這與破壁的方式存在很大的關(guān)聯(lián)性[11]。使用不同破壁方式處理的蜂花粉進行α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗，據(jù)此可以推測產(chǎn)生抑制作用的主要成分。目前關(guān)于破壁方式影響蜂花粉降血糖功效方面的研究還未見報道。對于蜂花粉功能活性的研究當前以醇提物為主，對水溶活性成分的報道比較少見。油菜蜂花粉在中國產(chǎn)量大，資源豐富，本試驗擬以不同破壁方式處理的油菜蜂花粉水溶活性成分為研究對象進行抑制α-葡萄糖苷酶的試驗，以期對花粉中抑制α-葡萄糖苷酶的主要成分進行篩選和評價，為開發(fā)出新的蜂花粉產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂花粉：油菜蜂花粉，市售；

蘆丁標準品：≥98%，國藥化學試劑有限公司；

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)：≥10 U/mg，美國Sigma公司；

4-硝基苯-α-D-喃葡萄糖苷(PNPG)：≥99%，美國Sigma公司；

葡萄糖標準品、磷酸二氫鈉、磷酸氧二鈉、三氯乙酸、無水乙醇、3,5-二硝基水楊酸、無水碳酸鈉等：分析純，國藥化學試劑有限公司；

纖維素酶：≥1 500 U/g，國藥化學試劑有限公司；

果膠酶：≥50 U/g，國藥化學試劑有限公司；

阿卡波糖：上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計：UV-1800型，日本島津公司；

高速離心機：2-16R型，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；

冷凍干燥機：Lab-1B-50E型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

超聲清洗儀：KQ-5200B型，昆山美美超聲儀器有限公司；

酶標儀：Multiskan FC型，美國Thermo Fisher公司；

掃描電鏡：JSM-6380LV型，日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 花粉破壁方式

(1) 溫差破壁：參照文獻[12]。

(2) 超臨界二氧化碳破壁：參照文獻[13]。

(3) 超聲輔助酶解破壁：參照文獻[14～15]略做改進，取去雜研磨均勻的花粉10 g加入纖維素酶0.2 g，果膠酶0.8 g，40 ℃震蕩酶解3 h，超聲3 h。

(4) 未破壁花粉：研磨均勻后溶于水。

各破壁方法保證花粉的料液比為1∶8 (g/mL)，抽濾，離心(7 000 r/min，10 min)取上清液備用，殘渣冷凍干燥后鏡檢。

1.3.2 花粉黃酮、多糖、還原糖含量的測定 以葡萄糖為標樣，用3，5-二硝基水楊酸法測定總糖和還原糖的含量兩者之差即為多糖含量[16]；以蘆丁為標樣，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量[17]。

1.3.3 粗多糖的提取 參照文獻[18～19]的方法略做改進。將破壁花粉以1∶8 (g/mL)的比例溶于熱水，95 ℃蒸餾水回流提取1 h，提取過程中加入3%的三氯乙酸去蛋白，提取液減壓濃縮至原體積的1/2，加3倍體積無水乙醇沉淀12 h；取沉淀用蒸餾水溶解，離心(7 000 r/min，10 min)取上清液，再次加入3倍體積無水乙醇沉淀12 h，收集沉淀，冷凍干燥即得粗多糖。

1.3.4 蜂花粉水提物對底物(PNPG)的作用 分別在96孔板中加入不同破壁方式處理的花粉水提物10 μL按照1.3.5(1) 的方式測定吸光值。試驗組：用緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液；對照組：用緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液和PNPG溶液。

1.3.5 酶反應條件的篩選

(1) 酶反應濃度的篩選：于96孔板中加入不同質(zhì)量濃度的α-葡萄糖苷酶溶液(0.000，0.893，1.786，3.571，5.357，7.143，8.929 μg/mL)140 μL，37 ℃孵育10 min，加入2.5 mmol/L 的PNPG 30 μL反應一定時間，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL終止反應，于405 nm處測吸光值[5]。

(2) 酶反應時間的篩選：取一定質(zhì)量濃度的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃孵育10 min，加入2.5 mmol/L的PNPG 30 μL 反應不同時間(0，10，15，20，25，30 min)后，加入0.2 mol/L Na2CO380 μL終止反應，于405 nm處測吸光值。

(3) 最優(yōu)條件下試驗樣品對酶的抑制作用：分別在96孔板中加入10 μL不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液(0，10，20，30，40，50，60 mg/mL)、不同破壁方式處理的花粉水提物10 μL、不同質(zhì)量濃度的花粉多糖溶液(0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL)按照1.3.5(1)的方式測定吸光值，對照組加10 μL緩沖溶液代替抑制劑，以3 mg/mL的阿卡波糖為陽性對照，試驗溫度37 ℃。每組平行試驗3次。按式(1)計算抑制率[5]。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

A1、A2——分別為對照樣的試驗組與空白組的吸光值；

A3、A4——分別為樣品的試驗組與空白組。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉破壁率及主要抑酶成分含量變化

黃酮類化合物與多糖類物質(zhì)是蜂花粉水溶性物質(zhì)中的主要功能成分，并且結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，近年來成為天然產(chǎn)物中的研究熱點。大量研究[20-23]表明，天然產(chǎn)物中的黃酮類和多糖類物質(zhì)具有降血糖的作用。本試驗以總黃酮和多糖的溶出率為指標結(jié)合破壁率，評價不同的花粉破壁方式，結(jié)果見表1。

由表1可知，各種破壁方式處理過的油菜蜂花粉破壁率及萌發(fā)孔打開率均明顯提高，證明破壁有效，破壁后的樣品多糖含量顯著增加，但總黃酮含量有增有減。相比于較溫和的溫差與超聲輔助酶法破壁方式，超臨界二氧化碳處理的花粉破壁率最高，但其總黃酮含量反而比未破壁的樣品低，說明在超臨界二氧化碳激烈的破壁的過程中造成了某些成分的損失或改變，孫麗萍等[13]的研究也有相似的結(jié)論。

2.2 蜂花粉水提物對底物(PNPG)的作用

蜂花粉中本身含有多種酶類物質(zhì)，如α-淀粉酶等[24]，可能會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。圖1顯示各處理方式得到的樣品試驗組和對照組之間無顯著性差異，說明花粉水提物本身并不會對底物產(chǎn)生影響進而影響到試驗結(jié)果。

表1 樣品破壁率、黃酮、多糖以及還原糖含量

圖1 樣品對底物的作用

2.3 酶反應條件的篩選

通過對酶濃度和時間的篩選，確定最佳反應條件為：酶質(zhì)量濃度1.786 μg/mL，反應時間15 min。

2.4 蜂花粉水提物對a-葡萄糖苷酶的抑制作用

圖2的結(jié)果顯示不同破壁方式處理樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率之間存在顯著性差異。超臨界二氧化碳流體處理的樣品減去還原糖后的抑制率出現(xiàn)負值(-8.07±0.93)%，另外3種樣品都為正值。溫差(13.73±1.15)%和超聲輔助酶法(16.70±0.87)%處理的樣品抑制率高于未處理樣品(9.68±0.89)%，說明花粉破壁后有助于抑酶因子的溶出。4種樣品的總抑制率均低于陽性對照的。這主要是因為蜂花粉水溶液中含有較多葡萄糖，對葡萄糖苷酶有抑制作用(圖3)而使結(jié)果出現(xiàn)假陽性，因此采用較低的試驗濃度消除葡萄糖的影響，阿卡波糖選擇3 mg/mL的濃度是為了與后面的多糖試驗濃度一致。蜂花粉成分復雜，富含多種生物活性物質(zhì)[25]，試驗結(jié)果表明其中含有天然α-葡萄糖苷酶抑制成分，對比表1與圖2可知，樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制效果與其中總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，可以推測蜂花粉中黃酮類化合物為α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖2 不同破壁方式處理的樣品的抑制率

超臨界二氧化碳流體處理的樣品對α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出促進作用，可能是處理過程中瞬間釋放高壓使原本溶于二氧化碳流體中的功能活性成分隨之釋放到大氣中[26]，導致抑酶因子的損失或失活，使得總體上出現(xiàn)負值?；谀壳坝筒朔浠ǚ壑饕亲鳛橐环N食物，因此無論是在研究還是加工食用過程中都應盡量使用相對溫和的破壁方式。

α-葡萄糖苷酶作用于α-1,4糖苷鍵，水解多糖為單糖，蜂花粉水提物中含有大量的單糖類物質(zhì)會對該酶起到負反饋抑制，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。由圖3可知，葡萄糖濃度與抑制率近似呈直線關(guān)系，由此可推算不同濃度的還原糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用已排除干擾。

圖3 葡萄糖抑制率

2.5 粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

蜂花粉破壁后多糖含量顯著增加，可能是使其對α-葡萄糖苷酶抑制率上升的原因?；ǚ壑悬S酮類化合物已有前人作了系統(tǒng)的研究，但多糖類對α-葡萄糖苷酶活性作用的研究卻罕有報道[8]。蜂花粉多糖功能多樣且安全，備受人們喜愛并成為研究熱點，現(xiàn)已被應用于醫(yī)藥、保健、化妝品等行業(yè)[27]。有研究[28]表明蜂花粉多糖類可以降低糖尿病小鼠的血糖值。因此，本試驗提取水溶性粗多糖進行α-葡萄糖苷酶抑制試驗，由圖4可知，油菜蜂花粉多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率極低，在(3.46±0.31)%～(-0.78±0.03)%間波動，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，并沒有出現(xiàn)明顯的規(guī)律，說明油菜蜂花粉粗多糖對α-葡萄糖苷酶活性沒有顯著影響。

圖4 多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結(jié)論

本試驗以油菜蜂花粉為研究對象，探索了蜂花粉水溶性成分對α-葡萄糖苷酶的作用，以及不同破壁方式對該作用的影響。試驗證明：經(jīng)過分離提取的蜂花粉水溶性多糖對α-葡萄糖苷酶活性無影響，該結(jié)果對蜂花粉降糖機理進行了理論補充，為后來的研究者提供了借鑒；蜂花粉水提物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率與黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系，破壁方式對其有顯著性影響；該結(jié)果證實了孫巖等[8-9]的結(jié)論，提示在生產(chǎn)和應用過程中應選擇合適的破壁方式處理蜂花粉。需要指出的是在相同抑制率的情況下，本試驗中實際加入的總黃酮含量遠低于孫巖等[8]的加入量，提示蜂花粉中可能還含有別的對α-葡萄糖苷酶有抑制作用的物質(zhì)有待研究與開發(fā)。

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Effects of wall breaking manners on the inhibition of alpha glucosidase activity in bee pollen

LIU Wen-jing1ZHANGZhi-xu2QINDan3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;2.StateKeyLaboratoryofSubhealthInterventionTechnology,Changsha,Hunan410128,China; 3.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China)

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.08.035

科技部國際科技合作專項(編號：2013DFA31790)

劉文靜，女，湖南農(nóng)業(yè)大學在讀碩士研究生。

張志旭(1972—)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學講師，博士。 E-mail: 532000632@qq.com

2017—05—19