李曉林，劉長彬,2

（1.石河子大學，石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學院，石河子 832003）

免疫學技術在奶牛妊娠檢查中的應用

李曉林1，劉長彬1,2

（1.石河子大學，石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學院，石河子 832003）

隨著規(guī)模化牛場養(yǎng)殖集約化程度的加深，妊娠檢查要求在30d之前達到高準確率，但現(xiàn)在的早期妊娠診斷方法明顯達不到要求。本文重點從免疫學方法入手，比較了不同方法針對不同內(nèi)源物質(zhì)在早期妊娠診斷上的技術難度、繁瑣程度、成本、精確程度，以期為后續(xù)早期妊娠診斷發(fā)展和研究提供方向。

奶牛；免疫學；早期妊娠診斷

目前，情期人工授精的受孕率頭胎奶牛為60%左右，而經(jīng)產(chǎn)奶牛僅有50%。未妊娠奶牛如不能及時檢出，就會導致繁殖周期的紊亂和產(chǎn)奶量的降低，直接影響經(jīng)濟效益[1]。故對配種后母牛及時觀察，或借助儀器和實驗室手段進行早期妊娠診斷在奶牛生產(chǎn)中有著非常重要的意義[2]。早期妊娠診斷具有兩方面作用：①確診已妊娠母畜，進而加強飼養(yǎng)管理，保證胎兒正常發(fā)育；②檢出未妊娠母畜，找出未孕原因，采取措施使其及時進入下一個情期，從而有效地提高母畜繁殖效率和減少經(jīng)濟損失[3]。

國內(nèi)目前對牛的早期妊娠診斷方法開展了大量研究。臨床上主要對孕體，包括胎兒、胎膜和胎水的存在與否及存在狀態(tài)進行檢查[4]，主要采用的方法是直腸檢查和超聲波檢查。直腸檢查需要獸醫(yī)有豐富、長期的基層工作經(jīng)驗，同時奶牛配后第一個情期即使通過尿膜羊膜囊觸摸法在30d之前也很難檢查出來[5]。超聲波檢查隨著技術的改進和方法的革新，在規(guī)模化牛場應用廣泛[6]。但是由于配后18～21d，B超還不能捕捉到可信度高的胎兒發(fā)育信號，故臨床上用于早期妊娠診斷的效果并不理想[7]。

奶牛妊娠實驗室診斷是依據(jù)從孕體、子宮、卵巢進入母體血液、尿液或乳汁的妊娠相關物質(zhì)含量來檢測奶牛是否懷孕，這些物質(zhì)包括孕馬血清促性腺激素（PMSG）、早孕因子(EPF)等特有妊娠因子和孕酮（P4）及硫酸雌銅等能產(chǎn)生變化的物質(zhì)[8]。對家畜進行早期妊娠診斷的實驗室方法較多，如放射免疫測定法、膠體金免疫檢測技術、酶免疫測定法等[9]。這些方法均應用了免疫學的原理和方法。

1 免疫學方法早期妊娠診斷的主要內(nèi)源物質(zhì)

1．1 孕酮

奶牛妊娠后的第1個情期（21d）內(nèi)，由于黃體的持續(xù)存在，孕酮水平相對于未妊娠牛較高[10]。孕酮在早期妊娠診斷中應用最廣泛。其來源于血液和乳汁中，由于乳汁中孕酮含量高于血液，同時也便于收集[11]，故乳汁中孕酮含量測定常作為判斷奶牛是否懷孕的依據(jù)。

1．2 糖蛋白

妊娠母牛胎盤滋養(yǎng)層雙核細胞可表達妊娠相關糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins, PAG）[12]。奶牛妊娠后，外周血液PAG濃度開始緩慢上升，妊娠22d可達2ng/mL以上，明顯高于未妊娠牛（低于0.2ng/mL），妊娠28d時最高可達5.4ng/mL[13]。這一生理特點為奶牛早期妊娠診斷提供了理論依據(jù)。奶牛外周血液PAG濃度檢測主要采用放射免疫測定法和酶聯(lián)免疫吸附試驗。其中放射性免疫法測定PAG的靈敏度已達0.2ng/mL。通過PAG進行早期妊娠診斷，奶牛人工授精28d后可取得90%以上的妊娠診斷準確率[14]。但妊娠相關糖蛋白檢測法需要的實驗室條件比較嚴格，檢測成本和技術要求都要求較高，同時也僅在奶牛受精28d后較超聲波和直腸檢查準確率高。

1．3 早孕因子

早孕因子（early pregnancy factor, EPF），亦稱免疫抑制性早孕因子和早期妊娠因子，是一種存在于牛乳和血清中的妊娠依賴性多分子蛋白復合物。在妊娠初期，早孕因子為抑制母體的細胞免疫而使胎兒免受免疫排斥而出現(xiàn)，接著在胎兒死亡或流產(chǎn)后很短時間內(nèi)便會消失，所以可以作為妊娠后胎兒存活的指示因子[15]。奶牛在受精24h后，血清和乳中可檢測到EPF，一旦妊娠終止，EPF立即消失[16]。李青旺等研究表明，奶牛配種后31～50d內(nèi)是最佳的乳汁中EPF檢測時間，采集早、中、晚3個時間點的乳樣進行檢測，中午乳汁中的EPF檢測結(jié)果與超聲波檢測法符合率最為接近[17]。基于不同的免疫學方法，EPF的檢測時間和準確率都不同。故早孕因子作為早期妊娠檢測僅限于小樣本實驗室檢測，在規(guī)?；鲋袘脻摿Σ淮?。

1．4 類絨毛膜促性腺激素（類hCG）

奶牛精卵結(jié)合后，在發(fā)育成胚胎和胚盤的過程中，分泌的類絨毛膜促性腺激素（類hCG）將隨乳汁和尿排出，因此檢測尿液或乳汁是否存在類hCG，可以作為早孕診斷的一種依據(jù)[18]。

2 奶牛早期妊娠診斷的免疫學方法

2．1 放射免疫測定法

放射免疫測定法簡稱RIA，是一種結(jié)合同位素放射高度靈敏性和免疫學抗原抗體間結(jié)合的微量分析方法[19]?；赗IA，可以通過檢測奶牛體內(nèi)、血漿和乳汁中的孕酮水平判斷奶牛是否懷孕[20]。Heap首次將結(jié)合競爭蛋白法改進為放射免疫分析法（二者均為放射性體外測定法，后者需制備特異性抗體，前者不需要抗體，靈敏度后者比前者高）。通過牛乳孕酮測定和卵巢評估結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，乳中孕酮濃度反映的發(fā)情周期階段與卵巢評估結(jié)果一致[21]。史遠剛等應用RIA法在奶牛配種22～24d測定乳汁中孕酮，結(jié)果妊娠確診率為92.3%，未妊娠確診率為100%[22]。蘇妮等用同樣的方法和標準對配種后21～26d的51頭奶牛進行早期妊娠診斷，診斷總準確率為84.31%[23]。白云等采用RIA檢測了85頭奶牛人工授精后第7、16、22、45天血樣和乳樣中的孕酮水平，發(fā)現(xiàn)第7天時檢測出的妊娠準確率和未孕準確率都比較低，不能作為早期妊娠檢測的依據(jù)。而在16d和22d時，血液樣本妊娠檢測的準確率為84.38%和90.16%，乳樣的妊娠檢測準確率為85.94%和88.71%。這表明血液和乳汁中孕酮水平的平行[24]。

RIA還能通過測定糖蛋白（PAG）和早孕因子（EPF）來進行早期妊娠判斷，且靈敏度已達0.2ng/mL，在奶牛人工授精28d后取得90%以上的妊娠診斷準確率[25,26]。雖然RIA法測定PAG的精確度和靈敏度高、檢測速度快，但對實驗設備條件和技術要求高、費時、有放射性危害，只能在專門實驗室進行，因而不能普及。

2．2 膠體金免疫檢測技術

在奶牛早期妊娠檢測中，膠體金免疫檢測技術是一種比較常見和快速的檢測技術。從20世紀70年代開始興起以來，膠體金在免疫學上的發(fā)展十分快速。該檢測方法實質(zhì)上就是蛋白質(zhì)分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程[27]。將膠體金作為一種示蹤標記物，檢測抗原抗體特異性反應，具有檢測速度快、使用方便、成本低廉等優(yōu)點。通過膠體金夾心法研制的早孕試紙對早期妊娠診斷十分有效。萬積成等將研制出的奶牛早孕診斷試紙應用于10家牛場的孕酮水平檢測，結(jié)果表明最低檢出量達5～8ng/mL，且無相關抗原交叉。該方法在奶牛配種后22～24d即可測定，孕牛陽性符合率為98.5%，陰性符合率為97.9%[28]。李志源等研制的奶牛孕酮半定量膠體金試紙條，能夠在5min內(nèi)完成檢測，相比萬積成的試紙，其陽性符合率較低（配種后22～26d的陽性符合率為85%），陰性符合率相差不大[29]。相比于其他免疫學方法，免疫膠體金檢測技術在奶牛早孕檢測上的應用有限，如美國僅公開了一種基于牛早期妊娠抗原的膠體金檢測方法[30]。但由于應用該方法制成的膠條有效期長，檢測穩(wěn)定，故有較大的應用前景。

2．3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA最早是由Dray等首先建立的又一早期妊娠診斷方法。此法簡單易學、診斷迅速、無需昂貴的儀器設備、成本低、無放射性污染等[31]。該法原理是用酶標記孕酮或糖蛋白，作用于底物TMB（3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺），產(chǎn)生顏色反應，根據(jù)顏色深淺判斷是否妊娠[32]。使用酶聯(lián)免疫方法進行早期妊檢的準確率和超聲波檢查法接近，但時間要提前幾天?，F(xiàn)已開發(fā)出敏感性和準確率均較高的奶牛孕酮診斷ELASA試劑盒，但成本較高。

Friedrich等和Green等使用ELISA檢測受精28d奶牛血液中的PAG，獲得較高的妊娠符合率，檢測結(jié)果與35d超聲波檢測水平一致[33,34]。Sliva等使用ELISA法測定27d血清中的PAG濃度，結(jié)果早期妊娠診斷的準確率可以達到93.7%[35]。郭大智等建立的現(xiàn)場檢測乳汁孕酮ELISA法，與直腸檢查和產(chǎn)犢情況核對，未孕的診斷準確率為100%，已孕的準確率為95.3%[36]。楊國林等建立的目視ELISA測定孕酮的方法，對人工授精后19～23d奶牛已孕的判定準確率為79.22%，未孕的判定準確率為95.45%[37]。酶聯(lián)免疫方法檢測PAG和孕酮提供了一種有效可靠的妊娠診斷方法，同時還能保持生產(chǎn)水平，是一種有發(fā)展前途的方法。

EPF最重要的性質(zhì)是沒有種屬特異性，故用ELISA法可以利用免疫小鼠制備的EPF抗體檢測牛血清中的EPF[38]。權(quán)凱等利用該法檢測奶牛血清中的陽性率與2個月后直腸檢查和B超結(jié)果一致。ELISA法對檢測EPF的準確率高，時間可在20d以內(nèi)，但成本較高，抗體的制備過程較為繁瑣，故在應用上有很大的難度[39]。

2．4 乳膠凝集抑制試驗（LAIT）

LAIT是一種免疫測定法，可以用來檢測乳汁或尿液中的類hcG和孕酮。在奶牛孕酮的早期妊娠檢測中，是利用孕酮單克隆抗體和由孕酮包被的膠珠進行的乳汁孕酮快速測定[40]。此診斷方法操作簡便，設備簡單，成本也低，且可在圈舍進行現(xiàn)場操作。

凌志忠等利用LAIT檢測兩批黑白花奶牛尿液，妊娠準確率均在50%左右，空懷牛檢測準確率均在87%以上[41]。劉深廷等用RIA、ELISA和LAIT法對配種后21～26d的奶牛進行了早孕診斷對比試驗，診斷總準確率分別為84.31%（43/51）、85.45%（47/55）和92.31%（72/78）[42]。根據(jù)結(jié)果來看，LAIT法比RIA法和ELISA法的準確率要高。Romagno等也比較了LAIT法和ELISA法在奶牛早孕診斷上的靈敏性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAIT法妊娠確診率為84.7%，比ELISA法低，未妊娠確診率為93.9%，較ELISA高[43]。LAIT法相對其他實驗室檢測手段具有靈敏性高、操作簡單、容易掌握等特點，且可現(xiàn)場進行，在奶牛早孕診斷方法應用中有很好的前景。

表1 硫酸銅法診斷EPF的比較

2．5 硫酸銅法和玫瑰花環(huán)抑制試驗

硫酸銅法和玫瑰花環(huán)抑制試驗在奶牛早期妊娠診斷中主要是用于檢測EPF。前者利用硫酸根能使EPF凝集的特性來分析牛乳中EPF含量。比較不同樣本和試驗條件下硫酸銅法的診斷結(jié)果見表1。表1顯示，李山平等在22d左右的陽性符合率可達98%，而其他幾組均達不到，可能是樣本數(shù)較少的原因。陳龍等34d后陽性符合率到達85.45%，與其他組的結(jié)果相比略低，可能是由于在大規(guī)模牛場應用時試驗條件所致。同時比較不同硫酸銅濃度對診斷結(jié)果的影響，可以看出5%的比3%的準確率要低。硫酸銅法在奶樣儲存上不方便，而且需肉眼判定結(jié)果，易受主觀因素影響。

玫瑰花環(huán)抑制試驗的原理是：把奶牛T淋巴細胞與另一種動物紅細胞（RBC）混合后，淋巴細胞會呈玫瑰花形，在EPF檢測中，應用該法如果玫瑰花環(huán)抑制滴度R值增加，則指示EPF存在[48]。精卵結(jié)合2～7d后，便可以通過玫瑰花環(huán)抑制試驗檢測出EPF活性，同時妊娠牛和未妊娠牛EPF值差異極顯著[49]。玫瑰花環(huán)抑制試驗測定已妊牛與未妊牛的EPF值，靈敏度高，最早在奶牛授精7d便可進行妊娠診斷，但檢測時間長，所需藥品試劑多，操作程序繁瑣，不適合大批樣本檢測。

3 小結(jié)

目前，雖己建立很多奶牛早期妊娠診斷方法，但效果均不能滿足現(xiàn)代奶牛養(yǎng)殖要求。直腸檢查法和超聲波檢查法均不能滿足18～21d內(nèi)進行早期妊娠診斷，同時對技術和設備有一定的要求[50]。實驗室方法近年來快速發(fā)展，能達到準確、靈敏的早期妊娠檢測要求，但是存在耗時長、現(xiàn)場操作性不強等缺點[51,52]。目前已開發(fā)出多種針對早期妊娠診斷的試劑盒。奶牛PAG-ELISA妊娠檢測試劑盒（愛德士公司）對人工授精后26～58d的奶牛妊娠診斷準確率能達到97.8%。應用層析式雙抗體夾心法原理研制的奶牛早孕診斷試紙(北京萬華生物工程有限公司)，對奶牛乳汁中孕酮最低檢出量達5～8ng/mL，孕牛陽性臨床符合率96.8%。還有研究出的奶牛早孕診斷試紙臨床檢測準確率達到93.4%。早孕試紙具有重要的經(jīng)濟意義和推廣價值，在準確率和運用方面都非常有優(yōu)勢。隨著生物免疫學的進步，將會有更多、更可靠的相關商品在奶牛早期妊娠診斷領域中脫穎而出，使發(fā)情鑒定及早期妊娠診斷發(fā)生革命性變化。

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Abstract:With the development of large-scale dairy farming intensification deepened, pregnancy inspection requirements before 30 days to achieve high accuracy, but the early pregnancy diagnosis method now was not up to the requirements. In this paper, the advantages and disadvantages of different methods for the diagnosis of early pregnancy were compared, in order to provide the direction for the development and research of early pregnancy diagnosis.

Key words:Cow; Immunology; Early pregnancy diagnosis

Advance of Immunology Technology in Early Pregnancy Diagnosis of Dairy Cows

LI Xiao-lin1, LIU Chang-bin1,2
(1.Shihezi University, Shihezi 832003; 2.Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science,Shihezi 832003)

S823.3

A

1004-4264（2017）09-0024-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.007

2017-01-19