林曉娟，李 靜，宋筱玉，唐中鋒，葛婷婷，孫慶梅

(甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050)

5 687例高通量基因測序產(chǎn)前篩查指征及結(jié)果分析

林曉娟，李 靜，宋筱玉，唐中鋒，葛婷婷，孫慶梅

(甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050)

目的探討孕期開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。方法回顧性分析在甘肅省婦幼保健院就診的自愿接受高通量基因測序產(chǎn)前篩查單胎妊娠孕婦5 687例，采用高通量測序平臺對孕婦外周血游離胎兒DNA進行測序分析，對測序結(jié)果進行生物信息分析，提示高風(fēng)險及性染色體異常者，進一步行羊膜腔穿刺進行胎兒染色體核型分析。結(jié)果5 687例孕婦中游離胎兒DNA高通量基因測序技術(shù)檢出37例21-三體高風(fēng)險，5例18-三體高風(fēng)險，2例13-三體高風(fēng)險，性染色體異常30例。羊水染色體核型分析證實其中30例胎兒21-三體，3例18-三體，性染色體異常12例，高通量基因測序技術(shù)對于21-三體陽性預(yù)測值可達97%。結(jié)論高齡孕婦是胎兒染色體異常的高危人群。高通量基因測序技術(shù)是胎兒21-三體的有效產(chǎn)前篩查方法，它具有無創(chuàng)、準(zhǔn)確的特點，且篩查結(jié)果不受孕周限制，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

高通量基因測序技術(shù)；產(chǎn)前篩查；21-三體；產(chǎn)前診斷

出生缺陷已成為影響人口素質(zhì)和群體健康水平的公共衛(wèi)生問題，染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷的重要因素，其中21-三體是最常見的常染色體疾病，發(fā)生率為1/800。三級預(yù)防措施中二級預(yù)防措施(產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷)是預(yù)防出生缺陷最有效的環(huán)節(jié)。近年來，高通量基因測序產(chǎn)前篩查技術(shù)的探索和實施，為臨床開辟了一條新的產(chǎn)前篩查模式。本研究總結(jié)甘肅省婦幼保健院已完成的5 687例高通量基因測序產(chǎn)前篩查結(jié)果，旨在探討高通量基因測序產(chǎn)前篩查的臨床應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇2014年1月到2016年5月在甘肅省婦幼保健院接受產(chǎn)前檢查的單胎妊娠孕婦5 687例，自愿參加孕期高通量基因測序產(chǎn)前篩查方案。高通量基因測序產(chǎn)前篩查指征如下：母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查結(jié)果臨界風(fēng)險孕婦、母體血清學(xué)產(chǎn)篩結(jié)果高風(fēng)險孕婦、高齡孕婦、未行孕早中期母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查、孕早期有服藥史、有不良孕史孕婦，自主要求高通量基因測序產(chǎn)前篩查等。孕婦年齡為20～43歲，孕周為12～32周，孕婦知情并自愿參加篩查。篩查前孕婦均簽署知情同意書并了解高通量基因測序產(chǎn)前篩查的局限性。

1.2方法

高通量基因測序產(chǎn)前篩查檢測是通過采集孕婦的外周血，提取游離DNA，采用第二代高通量測序結(jié)合生物信息分析，得出胎兒患染色體非整倍體疾病的風(fēng)險率。具體操作流程：①抽取孕婦5～10mL外周血；②血漿分離；③DNA提取；④文庫構(gòu)建；⑤上機測序；⑥數(shù)據(jù)分析；⑦生產(chǎn)報告。篩查結(jié)果為高風(fēng)險的孕婦做羊水穿刺進行產(chǎn)前診斷。

2結(jié)果

2.1高通量基因測序產(chǎn)前篩查異常檢出情況

5 687例孕婦接受高通量基因測序產(chǎn)前篩查，其中72人高通量基因測序產(chǎn)前篩查提示高風(fēng)險，經(jīng)產(chǎn)前診斷確診胎兒染色體異常共45例。其中高齡孕婦胎兒染色體核型異常比例占42.2%(19/45)，母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查臨界風(fēng)險者胎兒染色體核型異常比例占22.2%(10/45)，母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險者胎兒染色體核型異常比例占17.8%(8/45)，超聲檢查異常者胎兒染色體核型異常比例占11.1%(5/45)。

2.2高通量基因測序產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷的結(jié)果比較

本研究共5 687人參加高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查，21-三體高風(fēng)險37例，3例自行引產(chǎn)，1例胎死宮內(nèi)，1例失訪，1例拒絕產(chǎn)前診斷生后確診為21-三體綜合征，接受羊水穿刺產(chǎn)前診斷確診30例，共計31例21-三體，1例胎兒染色體核型分析提示無異常。31例胎兒染色體核型結(jié)果與高通量基因測序產(chǎn)前篩查結(jié)果一致，21-三體陽性預(yù)測值達97%。18-三體高風(fēng)險5例，3例接受羊水穿刺確診為18-三體綜合征，1例拒絕羊水穿刺胎兒生后3個月不明原因夭折，1例高通量基因測序檢測后胎死宮內(nèi)。性染色體異常30例，13-三體高風(fēng)險2例，均接受產(chǎn)前診斷確診，2例X0，4例XXX，5例XXY，1例XYY。隨訪結(jié)果假陰性0例。高通量基因測序產(chǎn)前篩查檢測性染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值較低，為40.0%(12/30)，見表1。

表1 高通量基因測序產(chǎn)前篩查高風(fēng)險結(jié)果及產(chǎn)前診斷的結(jié)果(n)

3討論

3.1高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查的臨床意義

如何降低出生缺陷發(fā)生率，仍是目前我國所面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。2001年我國開始實施出生缺陷干預(yù)工程，但我國的出生缺陷率仍高達5.6%，每年新增出生缺陷人數(shù)約90萬。二級預(yù)防是三級預(yù)防中最為主要的環(huán)節(jié)，出生缺陷產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷是減少出生缺陷最有效的預(yù)防手段之一。目前我國大部分機構(gòu)仍用傳統(tǒng)的孕中期母體血清甲胎蛋白和β絨毛膜促性腺激素的“二聯(lián)”產(chǎn)前篩查和“三聯(lián)”產(chǎn)前篩查(甲胎蛋白、β絨毛膜促性腺激素和妊娠相關(guān)蛋白A)為主。目前我院采用的篩查模式為孕早期“一站式”產(chǎn)前篩查，即母體血清學(xué)篩查(β絨毛膜促性腺激素和妊娠相關(guān)蛋白A)聯(lián)合胎兒頸項透明層的厚度進行早孕期產(chǎn)前篩查和孕中期母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查以“三聯(lián)”產(chǎn)前篩查為主。我國原衛(wèi)生部于2010年頒布實施了《胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》(WS322.1-2010)，該標(biāo)準(zhǔn)提出中孕期血清學(xué)篩查的目標(biāo)為：“二聯(lián)”篩查檢出率>60%，“三聯(lián)”篩查檢出率>70%，“四聯(lián)”篩查檢出率>80%，并對產(chǎn)前篩查的多個環(huán)節(jié)進行了規(guī)范和質(zhì)控[1]。但傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查方法根本無法避免假陰性率引起的醫(yī)療糾紛，對于篩查高危人群需再進一步進行羊水或臍血產(chǎn)前診斷。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，高通量基因測序逐漸成為產(chǎn)前篩查的新模式，其較血清學(xué)篩查具有更高的特異性和敏感性。其理論依據(jù)是孕婦母體外周血漿中存在胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)和胎兒游離RNA(cell-free fetal RNA，cffRNA)，胎兒染色體異常會引起游離DNA含量的微量變化[2]。我院2015年獲得國家首批臨床應(yīng)用高通量基因測序產(chǎn)前篩查技術(shù)試點單位資質(zhì)，至2016年共完成5 687例，其中37例21-三體高風(fēng)險，5例18-三體高風(fēng)險，性染色體異常30例，接受羊水穿刺胎兒染色體核型分析，確診30例為21-三體綜合征，1例21-三體高風(fēng)險行羊水穿刺后胎兒染色體核型無異常，18-三體綜合征3例，2例X0，4例XXX，5例XXY，1例XYY，隨訪結(jié)果假陰性0例。31例胎兒染色體核型結(jié)果與高通量基因測序產(chǎn)前篩查結(jié)果一致，對21-三體陽性預(yù)測值達97%。本研究中高通量基因測序產(chǎn)前篩查18-三體及13-三體高風(fēng)險者較少，有待于今后的工作中進一步探討。高通量基因測序技術(shù)對于性染色體非整倍體異常的陽性預(yù)測值較低，為40.0%，可能與本技術(shù)存在一定的缺陷有關(guān)[3]。因此對于性染色體非整倍體異常的確診需通過羊水或臍血胎兒染色體核型分析才能確診。與孕中期血清學(xué)篩查相比，高通量基因測序檢出率明顯提高。高通量基因測序產(chǎn)前篩查是一項精確度接近于產(chǎn)前診斷的篩查新技術(shù)。大量文獻證實，高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查可提高產(chǎn)前篩查效率，降低產(chǎn)前篩查假陽性率，在診斷胎兒非整倍體畸形方面顯示出巨大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿4-5]。高通量基因測序產(chǎn)前篩查對21-三體的高敏感度、特異度、陽性預(yù)測值及正確率，與染色體核型分析技術(shù)有較高的一致性，且高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查不僅有效緩解了孕婦及家屬的心理壓力，而且接受度較羊水穿刺明顯提高。它避免了產(chǎn)前診斷引起的胎兒流產(chǎn)、孕婦焦慮等并發(fā)癥。由此可見，高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查技術(shù)是胎兒21-三體的有效篩查方法。

3.2高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查應(yīng)用的前景

有文獻證實，高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查方法具有操作直接、簡便無創(chuàng)、準(zhǔn)確性高、孕周范圍廣的特點，且篩查結(jié)果不受孕周不明確、妊娠合并癥等因素影響，缺憾是費用過高[6]。近年來，隨著我國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，我國在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)具體實施、基因檢測行業(yè)規(guī)范、質(zhì)檢質(zhì)評、標(biāo)準(zhǔn)指南等方面均取得了重要進展。2017年部分發(fā)達城市將高通量基因測序孕期產(chǎn)前篩查價格大幅降低或納入醫(yī)療保險。2014年英國皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會發(fā)表了第15號科學(xué)影響性文件，對無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(NIPT)這一臨床技術(shù)進行了評估，并將NIPT納入英國國家醫(yī)療服務(wù)體系，提供了備選方案和建議[7]。但我省地處西部地區(qū)，經(jīng)濟、文化水平欠發(fā)達，仍有一部分孕婦認(rèn)為產(chǎn)前篩查具有不確定性，或錯過產(chǎn)前篩查時機，或因當(dāng)?shù)匚撮_展而不知曉產(chǎn)前篩查等而未行產(chǎn)前篩查；也有少部分人單一地考慮產(chǎn)前診斷的創(chuàng)傷性，存在僥幸心理拒絕進一步的產(chǎn)前診斷而導(dǎo)致21-三體綜合征患兒的出生[8]。本研究中有11例孕婦因母體血清學(xué)篩查檢測結(jié)果為臨界風(fēng)險進而選擇高通量基因測序最終確診胎兒為染色體數(shù)目異常。高通量基因測序可作為母體血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險孕婦的有效補充檢測手段。本研究顯示，孕婦高齡、母體血清學(xué)產(chǎn)前篩查高風(fēng)險及臨界風(fēng)險、超聲異常是高通量基因測序預(yù)測胎21-三體綜合征的有效指標(biāo)，其中高齡孕婦仍是胎兒染色體異常的高危人群。因此，加強高危孕婦及高齡孕婦的管理，積極地進行健康教育，提高產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷的依從性，可有效減少不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

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[專業(yè)責(zé)任編輯： 于學(xué)文]

Indicationsandresultanalysisof5 687casestakinghighthroughputgenesequencingprenatalscreening

LIN Xiao-juan, LI Jing, SONG Xiao-yu, TANG Zhong-feng, GE Ting-ting, SUN Qing-mei

(GansuMaternalandChildHealthCareHospital,GansuLanzhou730050,China)

ObjectiveTo explore the clinical value of application of high throughput gene sequencing prenatal screening technique during pregnancy.MethodsAltogether 5 687 pregnant women with singleton pregnancy visiting Gansu Maternal and Child Health Care Hospital and voluntarily receiving high throughput gene sequencing for prenatal screening were retrospectively analyzed. Free fetal DNA in maternal peripheral blood was sequenced using high throughput sequencing platform. Bioinformatics analysis was performed on sequencing results. Fetal chromosomal karyotype analysis was perfromed through amniocentesis in cases which were indicated to have high risks and sex chromosomal abnormalities.ResultsIn free fetal DNA from 5 687 pregnant women, high throughput gene sequencing technology detected that 37 cases had high risk of 21-trisomy, 5 cases had high risk of 18-trisomy, 2 cases had high risk of 13-trisomy, and 30 cases had sex chromosome abnormality. Among them 30 cases of 21-trisomy, 3 cases of 18-trisomy, and 12 cases of sex chromosome abnormalities were confirmed by amniotic fluid chromosome karyotype analysis. Positive predictive value of high throughput gene sequencing technology for 21-trisomy was as high as 97%.ConclusionElderly pregnant women are at high risk of fetal chromosomal abnormalities. High throughput gene sequencing is an effective prenatal screening method for fetal 21-trisomy. It has the features of noninvasion and high accuracy, and its screening results are not restricted by gestational age. Therefore, it has high clinical application value.

high throughput gene sequencing technology; prenatal screening; 21-trisomy; prenatal diagnosis

R714.5

A

1673-5293(2017)10-1279-03

2017-02-10

甘肅省出生缺陷防控重點實驗室培育基地資助(1506RTSA158)，甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(1606RJZA171)

林曉娟(1975—)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生，主要從事產(chǎn)前優(yōu)生咨詢及胎兒醫(yī)學(xué)的研究。

孫慶梅，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.10.039