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        脂質(zhì)體熒光探針檢測磷脂酶C的活性

        2017-10-16 07:39:19谷巧榮艾俊杰張倩云董雅男高強(qiáng)
        分析化學(xué) 2017年9期

        谷巧榮+艾俊杰+張倩云+董雅男+高強(qiáng)

        摘要建立了一種以熒光標(biāo)記脂質(zhì)體為探針檢測磷脂酶 C (PLC) 活性的新方法。此熒光探針是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和麗絲胺羅丹明B標(biāo)記的熒光磷脂(Liss Rhod PE)通過自組裝形成有序的熒光標(biāo)記脂質(zhì)體,探針脂質(zhì)體中Liss Rhod PE由于相互之間距離靠近產(chǎn)生自猝滅效應(yīng),因而作為探針的脂質(zhì)體并不表現(xiàn)出熒光性質(zhì)。當(dāng)在此探針溶液中加入目標(biāo)物PLC,PLC可以水解切割標(biāo)記在磷脂?;簧系臒晒鈭F(tuán)羅丹明,使其從脂質(zhì)體釋放到溶液中,導(dǎo)致自猝滅效應(yīng)的減弱,溶液熒光信號增強(qiáng),以此實現(xiàn)對PLC活性的檢測。使用此探針檢測PLC活性,熒光強(qiáng)度的增加值與PLC濃度在5~300 U/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢出限為2 U/L(S/N=3)。此外,此探針還可用于PLC抑制劑的篩選。

        [KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞熒光; 脂質(zhì)體; 探針; 磷脂酶C; 抑制劑

        1引 言

        磷脂酶降解磷脂產(chǎn)生自由的脂肪酸、血溶性脂、膽堿和磷脂酸[1]。磷脂酶降解磷脂的過程包含了一系列生物作用,如新陳代謝、消化、炎癥反應(yīng)、膜運(yùn)輸、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)[1,2]。磷脂酶是一個大家族,磷脂酶C(PLC)是其中的重要一員,它可以催化水解磷脂分子中的磷酸酯鍵,水解產(chǎn)物為二酰基甘油和磷酸膽堿[3]。這種水解過程與一些癌細(xì)胞中異常的膽堿代謝有關(guān)[4]。因而快速、靈敏的檢測體液中的PLC活性極為重要。

        目前,常見的檢測PLC酶活性的方法有核磁共振法[5]、比濁法[6]、放射性測定法[7]、色譜法[8]等,上述方法各具特色且大都具有較高的靈敏度,但通常需要昂貴的儀器且操作繁瑣。因此,簡單、靈敏的檢測磷脂酶活性的方法越來越為人們所關(guān)注。近年來,熒光光譜法因其具有靈敏、快速和操作簡單的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于酶活性檢測和酶抑制劑的篩選研究[9]。除了常規(guī)的分析方法,基于功能化的納米粒子的熒光法也已被應(yīng)用于磷脂酶活性檢測。如Sun 等合成了具有熒光的功能化金納米簇,利用熒光光譜法測定了酸性磷酸酶[10]、乙酰膽堿酯酶[11]和焦磷酸酶[12]的活性。Liu等[13]將羅丹明標(biāo)記磷脂組裝到石墨烯兩側(cè),利用石墨烯猝滅羅丹明熒光制得了納米探針。在磷脂酶D存在時,磷脂酶D切割磷脂釋放羅丹明,體系熒光增強(qiáng)。據(jù)此實現(xiàn)了磷脂酶D活性的高靈敏檢測。Chen等[14]使用磷脂分子和金納米粒子制備了一種具備熒光性質(zhì)的脂質(zhì)體金納米粒子復(fù)合物, PLC可以切割磷脂分子破壞脂質(zhì)體復(fù)合物,減小氧自由基對探針熒光的抑制,通過檢測熒光的增強(qiáng)實現(xiàn)了PLC活性的檢測。作為磷脂酶的天然底物,利用熒光標(biāo)記的磷脂分子形成的脂質(zhì)體探針正越來越多的被用于磷脂酶的檢測[15]以及藥物載體[16]。相對于游離的脂質(zhì)體,磷脂酶對形成脂質(zhì)體的磷脂通常具有更高的催化活性。本研究采用熒光分子羅丹明標(biāo)記的磷脂通過混合自組裝制備了脂質(zhì)體熒光探針,羅丹明因自猝滅效應(yīng)并不表現(xiàn)出明顯的熒光。利用PLC水解構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂釋放熒光分子羅丹明,通過熒光增強(qiáng)實現(xiàn)了PLC活性的檢測。

        2實驗部分

        2.1儀器與試劑

        F7000熒光儀(日本日立公司);Zetasizer NanoZS90激光粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

        二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1,2Dipalmitoylsnglycero3phosphocholine,DPPC)和麗絲胺羅丹明B標(biāo)記的磷脂酰乙醇胺(1,2Dimyristoylsnglycero3phosphoethanolamineN(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt),Liss Rhod PE)均購自Avanti Polar Lipids公司;磷脂酶C(PLC,來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌)、曲通X100和羥乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES)(SigmaAldrich公司);PLC酶抑制劑U73122(Selleck公司); CaCl2(西安化學(xué)試劑廠)。所用試劑均為分析純,緩沖溶液和儲備溶液均使用超純水(Millipore MilliQultrapureQ,>18.2 MΩ cm)配制。

        2.2實驗方法

        2.2.1探針的制備將0.2 mg Liss Rhod PE (200 μL 1 mg/mL儲備液)、0.8 mg DPPC(32 μL 25 mg/mL儲備液)的氯仿溶液混合,在超聲條件下逐滴加入到3 mL水中,超聲至溶液均勻, 避光放置過夜,即得到熒光脂質(zhì)體探針, 4℃保存。

        2.2.2熒光檢測將50 μL PLC加入到100 μL 10.0 mmol/L HEPES(含2 mmol/L CaCl2,pH=7.4)緩沖液和50 μL探針的混合液中,室溫下檢測其熒光強(qiáng)度并記錄數(shù)據(jù)。熒光檢測條件:掃速240 nm/min,激發(fā)波長530 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm,PMT=700 V,熒光測定使用1 mm×10 mm熒光比色皿。

        2.2.3鈣離子的影響在原有10.0 mmol/L HEPES(含2 mmol/L CaCl2, pH=7.4)緩沖溶液中加入5 mmol/L EDTA,并在此緩沖液中按上述步驟測定加入100 U/L PLC對探針液進(jìn)行水解后的熒光強(qiáng)度。

        2.2.4抑制劑實驗將不同濃度的U73122與濃度為100 U/L PLC培養(yǎng)20 min后,將其混合液加入到探針液中進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。

        3結(jié)果與討論

        3.1實驗原理圖

        使用二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和羅丹明B標(biāo)記的熒光磷脂(Liss Rhod PE)制備熒光標(biāo)記脂質(zhì)體探針,用于PLC活性的檢測。檢測原理如圖1所示,當(dāng)DPPC和Liss Rhod PE通過自組裝形成脂質(zhì)體,熒光標(biāo)記分子羅丹明之間的距離被拉近,出現(xiàn)熒光自猝滅現(xiàn)象。脂質(zhì)體探針并不表現(xiàn)出熒光性質(zhì)。當(dāng)PLC存在時,PLC催化水解磷脂釋放出熒光分子羅丹明,使得強(qiáng)熒光物質(zhì)羅丹明B[17]熒光得以恢復(fù)?;诹_丹明B熒光的增強(qiáng)實現(xiàn)PLC活性的檢測,這一探針也可用于PLC抑制劑的篩選。endprint

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