谷巧榮+艾俊杰+張倩云+董雅男+高強(qiáng)

摘要建立了一種以熒光標(biāo)記脂質(zhì)體為探針檢測磷脂酶 C （PLC） 活性的新方法。此熒光探針是由二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和麗絲胺羅丹明B標(biāo)記的熒光磷脂（Liss Rhod PE）通過自組裝形成有序的熒光標(biāo)記脂質(zhì)體，探針脂質(zhì)體中Liss Rhod PE由于相互之間距離靠近產(chǎn)生自猝滅效應(yīng)，因而作為探針的脂質(zhì)體并不表現(xiàn)出熒光性質(zhì)。當(dāng)在此探針溶液中加入目標(biāo)物PLC，PLC可以水解切割標(biāo)記在磷脂?；簧系臒晒鈭F(tuán)羅丹明，使其從脂質(zhì)體釋放到溶液中，導(dǎo)致自猝滅效應(yīng)的減弱，溶液熒光信號增強(qiáng)，以此實現(xiàn)對PLC活性的檢測。使用此探針檢測PLC活性，熒光強(qiáng)度的增加值與PLC濃度在5～300 U/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為2 U/L（S/N=3）。此外，此探針還可用于PLC抑制劑的篩選。

[KH*3/4D][HTH]關(guān)鍵詞熒光； 脂質(zhì)體； 探針； 磷脂酶C； 抑制劑

1引 言

磷脂酶降解磷脂產(chǎn)生自由的脂肪酸、血溶性脂、膽堿和磷脂酸[1]。磷脂酶降解磷脂的過程包含了一系列生物作用，如新陳代謝、消化、炎癥反應(yīng)、膜運(yùn)輸、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)[1，2]。磷脂酶是一個大家族，磷脂酶C（PLC）是其中的重要一員，它可以催化水解磷脂分子中的磷酸酯鍵，水解產(chǎn)物為二酰基甘油和磷酸膽堿[3]。這種水解過程與一些癌細(xì)胞中異常的膽堿代謝有關(guān)[4]。因而快速、靈敏的檢測體液中的PLC活性極為重要。

目前，常見的檢測PLC酶活性的方法有核磁共振法[5]、比濁法[6]、放射性測定法[7]、色譜法[8]等，上述方法各具特色且大都具有較高的靈敏度，但通常需要昂貴的儀器且操作繁瑣。因此，簡單、靈敏的檢測磷脂酶活性的方法越來越為人們所關(guān)注。近年來，熒光光譜法因其具有靈敏、快速和操作簡單的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于酶活性檢測和酶抑制劑的篩選研究[9]。除了常規(guī)的分析方法，基于功能化的納米粒子的熒光法也已被應(yīng)用于磷脂酶活性檢測。如Sun 等合成了具有熒光的功能化金納米簇，利用熒光光譜法測定了酸性磷酸酶[10]、乙酰膽堿酯酶[11]和焦磷酸酶[12]的活性。Liu等[13]將羅丹明標(biāo)記磷脂組裝到石墨烯兩側(cè)，利用石墨烯猝滅羅丹明熒光制得了納米探針。在磷脂酶D存在時，磷脂酶D切割磷脂釋放羅丹明，體系熒光增強(qiáng)。據(jù)此實現(xiàn)了磷脂酶D活性的高靈敏檢測。Chen等[14]使用磷脂分子和金納米粒子制備了一種具備熒光性質(zhì)的脂質(zhì)體金納米粒子復(fù)合物， PLC可以切割磷脂分子破壞脂質(zhì)體復(fù)合物，減小氧自由基對探針熒光的抑制，通過檢測熒光的增強(qiáng)實現(xiàn)了PLC活性的檢測。作為磷脂酶的天然底物，利用熒光標(biāo)記的磷脂分子形成的脂質(zhì)體探針正越來越多的被用于磷脂酶的檢測[15]以及藥物載體[16]。相對于游離的脂質(zhì)體，磷脂酶對形成脂質(zhì)體的磷脂通常具有更高的催化活性。本研究采用熒光分子羅丹明標(biāo)記的磷脂通過混合自組裝制備了脂質(zhì)體熒光探針，羅丹明因自猝滅效應(yīng)并不表現(xiàn)出明顯的熒光。利用PLC水解構(gòu)成脂質(zhì)體的磷脂釋放熒光分子羅丹明，通過熒光增強(qiáng)實現(xiàn)了PLC活性的檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

F7000熒光儀（日本日立公司）；Zetasizer NanoZS90激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

二棕櫚酰磷脂酰膽堿（1，2Dipalmitoylsnglycero3phosphocholine，DPPC）和麗絲胺羅丹明B標(biāo)記的磷脂酰乙醇胺（1，2Dimyristoylsnglycero3phosphoethanolamineN（lissamine rhodamine B sulfonyl） （ammonium salt），Liss Rhod PE）均購自Avanti Polar Lipids公司；磷脂酶C（PLC，來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌）、曲通X100和羥乙基哌嗪乙硫磺酸 （HEPES）（SigmaAldrich公司）；PLC酶抑制劑U73122（Selleck公司）； CaCl2（西安化學(xué)試劑廠）。所用試劑均為分析純，緩沖溶液和儲備溶液均使用超純水（Millipore MilliQultrapureQ，>18.2 MΩ cm）配制。

2.2實驗方法

2.2.1探針的制備將0.2 mg Liss Rhod PE （200 μL 1 mg/mL儲備液）、0.8 mg DPPC（32 μL 25 mg/mL儲備液）的氯仿溶液混合，在超聲條件下逐滴加入到3 mL水中，超聲至溶液均勻， 避光放置過夜，即得到熒光脂質(zhì)體探針， 4℃保存。

2.2.2熒光檢測將50 μL PLC加入到100 μL 10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2，pH=7.4）緩沖液和50 μL探針的混合液中，室溫下檢測其熒光強(qiáng)度并記錄數(shù)據(jù)。熒光檢測條件：掃速240 nm/min，激發(fā)波長530 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度5 nm，PMT=700 V，熒光測定使用1 mm×10 mm熒光比色皿。

2.2.3鈣離子的影響在原有10.0 mmol/L HEPES（含2 mmol/L CaCl2， pH=7.4）緩沖溶液中加入5 mmol/L EDTA，并在此緩沖液中按上述步驟測定加入100 U/L PLC對探針液進(jìn)行水解后的熒光強(qiáng)度。

2.2.4抑制劑實驗將不同濃度的U73122與濃度為100 U/L PLC培養(yǎng)20 min后，將其混合液加入到探針液中進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。

3結(jié)果與討論

3.1實驗原理圖

使用二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和羅丹明B標(biāo)記的熒光磷脂（Liss Rhod PE）制備熒光標(biāo)記脂質(zhì)體探針，用于PLC活性的檢測。檢測原理如圖1所示，當(dāng)DPPC和Liss Rhod PE通過自組裝形成脂質(zhì)體，熒光標(biāo)記分子羅丹明之間的距離被拉近，出現(xiàn)熒光自猝滅現(xiàn)象。脂質(zhì)體探針并不表現(xiàn)出熒光性質(zhì)。當(dāng)PLC存在時，PLC催化水解磷脂釋放出熒光分子羅丹明，使得強(qiáng)熒光物質(zhì)羅丹明B[17]熒光得以恢復(fù)?；诹_丹明B熒光的增強(qiáng)實現(xiàn)PLC活性的檢測，這一探針也可用于PLC抑制劑的篩選。endprint