梁曉芳，牟建樓，*，嚴超，宋春華，尹斯雅，劉建達

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.保定市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，河北保定071000；3.定州農(nóng)業(yè)局，河北定州073000）

響應(yīng)面優(yōu)化蝦夷扇貝抗氧化肽酶解液工藝研究

梁曉芳1，牟建樓1，*，嚴超1，宋春華1，尹斯雅2，劉建達3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.保定市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，河北保定071000；3.定州農(nóng)業(yè)局，河北定州073000）

為制備富含抗氧化肽的扇貝酶解液，以蝦夷扇貝為原料，以水解度和DPPH自由基清除率為指標，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化扇貝蛋白的生物酶解工藝，并測定了富含活性肽酶解液的體外抗氧化性。結(jié)果表明：扇貝蛋白生物酶解適宜工藝參數(shù)為蛋白酶用量3.1%，酶作用溫度45℃，作用時間4.5 h，此工藝參數(shù)下酶解液DPPH自由基清除率為82.06%，總抗氧化能力為0.11 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為0.37 U/g prot，羥自由基清除率為55.31%。

蝦夷扇貝；生物酶解；抗氧化性

Abstract：In order to get antioxidant peptide，the response surface experiment on enzymatic hydrolysis conditions was optimized and the in vitro antioxidant activity of the active peptide hydrolyzate was determined with the Patinopecten yessoensis as raw material and the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate as the indexs.The results showed that the appropriate amount of enzyme was 3.1%，hydrolysis temperature was 45℃，enzymolysis time was 4.5 h.The DPPH radical scavenging rate was 82.06%under the process parameters.And the total antioxidant capacity of the enzymatic hydrolysateof Patinopecten yessoensis was 0.11 U/mg prot，the anti superoxide anion activity was 0.37 U/g prot，the scavenging rate of hydroxyl radical was 55.31%.

Key words：Patinopecten yessoensis；enzymatic hydrolysis；antioxidant

扇貝是我國沿海地區(qū)的主要養(yǎng)殖物種，其年產(chǎn)量可達到我國總養(yǎng)殖量的81.59%[1]。扇貝富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、微量元素和B族維生素等。經(jīng)常食用貝類食品可以有效地預(yù)防心臟病、中風以及老年癡呆癥[2-7]。蝦夷扇貝主要分布在俄羅斯、日本及朝鮮北部海域等[8]，是世界上最重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類之一。

利用生物酶解法處理扇貝，所得酶解液具有多種優(yōu)點，一方面其營養(yǎng)價值高，便于儲存和運輸，另一方面富含活性肽。活性肽的研究日益成為現(xiàn)代海洋動物研究的重點，它可以有效地清除自由基，動物及病理模型實驗也已經(jīng)證明了多肽具有良好的生理活性[9-11]。另外，扇貝蛋白酶解后會表現(xiàn)出良好的溶解性，較強的乳化性和較好的流動性。因此，扇貝多肽可以作為天然的抗氧化劑在藥品、日用品、食品工業(yè)等方面進行開發(fā)和利用[12]。

目前所見報道多為利用海灣扇貝和扇貝下腳料進行生物酶解、功能研究等[13-15]。本研究將對蝦夷扇貝的生物酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化，制取富含生物活性肽的酶解液，并對酶解液的抗氧化性進行研究，為后期將酶解液應(yīng)用于研發(fā)具有抗氧化活性的扇貝發(fā)酵調(diào)味品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝：秦皇島洪嘉食品有限公司，冷凍保存。

中性蛋白酶（＞6 000 U/mg）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；甲醛（分析純）：天津市福晨化學試劑有限公司；DPPH：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、抗超氧陰離子試劑盒（A052）：南京建成生物工程研究所。

HH-2電熱恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；Neofuge15R高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；JJ-2組織勻漿機：金壇市億通電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 扇貝酶解工藝流程

扇貝解凍→去除內(nèi)臟，清洗→絞成肉糜→稱量→加水勻漿→調(diào)節(jié)pH值→酶解→100℃滅酶→4 500 r/min離心15 min→取上清液→扇貝酶解液

1.2.2 蛋白酶種類的選擇

選用4種生物蛋白酶對扇貝蛋白質(zhì)進行酶解，以水解度和DPPH自由基清除率為指標，各處理互為對照，試驗重復(fù)3次。各種酶的處理條件見表1。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different types of proteases

1.2.3 扇貝酶解的單因素試驗

以水解度和DPPH自由基清除率為指標，在其他因素保持不變的條件下，分別考察加酶量（1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%）、酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解時間（3.5、4、4.5、5、5.5 h）對酶解效果的影響。試驗重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率（Y）為因變量，酶解時間（X1）、酶解溫度（X2）、加酶量（X3）為自變量，采用響應(yīng)面法優(yōu)化蝦夷扇貝蛋白酶酶解參數(shù)，試驗設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 水解度的測定

總氮含量測定：采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定中凱氏定氮法》；氨基酸態(tài)氮（AAN）含量測定：采用GB 5009.235-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定中甲醛值法》；水解度（DH）計算公式：

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定

參照夏光華[16]的方法，并稍作修改。在具塞試管中先后加入1.5 mL樣品，1.5 mL蒸餾水，1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，然后倒入比色皿中在517 nm下測其吸光值記為As，空白組則用1.5 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定其吸光值記為Ax；對照組用1.5 mL蒸餾水代替樣品，測定其吸光值記為A0，并以等體積的蒸餾水空白調(diào)零，DPPH自由基清除率AOA按以下公式計算：

1.2.7 羥自由基清除率的測定

參照田倩[17]的方法，并稍作修改。向具塞試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL，0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.4）1 mL，待測樣品溶液1 mL及0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后加入體積分數(shù)為0.01%的H2O2溶液1 mL搖勻，37℃水浴1 h，在536 nm波長下測定吸光度（A樣）；用去離子水代替樣品溶液測定損傷管吸光度（A損）；用去離子水代替樣品溶液和H2O2測定未損傷管吸光度（A未損）；參照組為等體積的樣品溶液、磷酸鹽緩沖溶液和去離子水，測定吸光度（A參）；空白組為等體積的去離子水和磷酸鹽緩沖溶液，測定其吸光度（A空）。羥自由基清除率的計算公式為：

1.2.8 總抗氧化能力測定

參照試劑盒說明書。

1.2.9 抗超氧陰離子活力的測定

參照試劑盒說明書。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

蛋白酶酶解蝦夷扇貝結(jié)果如圖1所示。

圖1 蛋白酶種類對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of protease types on the degree of hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

由圖1可知，用中性蛋白酶酶解后的水解度達到31.75%，DPPH自由基清除率為69.26%，顯著高于用其他酶的酶解效果（P＜0.05）。考慮原因為中性蛋白酶為內(nèi)肽酶，且水解的特異性較寬[18]，切割位點比較廣[19]，所以酶解效果較好。綜合考慮水解度和DPPH自由基清除率，選用中性蛋白酶對蝦夷扇貝進行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化酶解試驗。

2.2 扇貝酶解的單因素試驗

2.2.1 加酶量對扇貝酶解效果的影響

中性蛋白酶加酶量對蝦夷扇貝酶解效果的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著生物酶使用量的增加，蝦夷扇貝的水解度呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)，DPPH自由基清除率先升高后降低，當加酶量為3.0%時，DPPH自由基清除率達到最大值75.20%。因為當?shù)孜餄舛茸銐虼髸r，酶解反應(yīng)隨著加酶量的增加而增加。當酶濃度增大到一定濃度時，反應(yīng)體系中底物將會出現(xiàn)不足，酶解效率將不再上升甚至會降低。DPPH自由基清除率降低，是因為酶將蛋白質(zhì)水解為活性多肽后，又將多肽水解為更短的肽鏈或氨基酸。所以本研究選擇3.0%作為適宜加酶量。

圖2 加酶量對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.2.2 酶解溫度對酶解效果的影響

溫度對蛋白酶酶解效果的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of tcmpcrature on the hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，水解度和DPPH自由基清除率均表現(xiàn)為先升高后降低趨勢。中性蛋白酶在45℃下作用于扇貝蛋白，水解度達到最大為28.74%，酶解液DPPH自由基清除率也升高到最大值73.34%?？紤]到溫度升高，酶促反應(yīng)速率加快，但是扇貝蛋白在溫度高時會變性，而且酶本質(zhì)上是蛋白質(zhì)也會發(fā)生變性，所以溫度過高時酶解效果會變差。因此確定45℃為扇貝生物酶解的適宜溫度。

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

蛋白酶酶解時間對酶解效果的影響如圖4所示。

由圖4可知，隨著生物酶作用時間的增加，扇貝蛋白水解度先增大后趨于不變，DPPH自由基清除率先升高后降低。蝦夷扇貝的水解度在4.5 h后變化不顯著，DPPH自由基清除率在4.5 h時達最大值為74.07%。隨作用時間的延長，酶對蛋白質(zhì)逐漸進行酶解，使水解度逐漸增加，底物量逐漸減少，最后水解度幾乎不變，而且多肽又被酶解成了氨基酸，所以DPPH自由基清除率升高后降低。因此本研究選擇4.5 h為適宜酶解作用時間。

圖4 時間對水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time hydrolysis and DPPH radical scavenging rate

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 試驗分析結(jié)果

中性蛋白酶酶解條件響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

利用Design expert8.0.5軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，得擬合二次多項式方程：對回歸模型進行方差分析，分析的結(jié)果見表4。

表4 回歸模型顯著性檢驗結(jié)果Table 4 Significance test for regression model

由表 4 可知，模型 F 值為 31.40，P＜0.000 1，說明該模型具有顯著性，且總體上模型因素的水平項也顯著。失擬項P=0.736 9＞0.05，說明未知因素對試驗干擾很小，模型擬合度較好。模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.975 8，說明方程的因變量與自變量間的線性關(guān)系顯著。綜合上述各參數(shù)表明該試驗設(shè)計方法可靠，因素水平區(qū)間設(shè)計合理，因此可以用此回歸模型模擬蛋白酶水解扇貝的DPPH自由基清除率在不同因素水平下響應(yīng)值的變化。

根據(jù)回歸模型的分析及檢驗結(jié)果，繪制響應(yīng)面圖（如圖5～圖7所示）以確定酶解時間（X1）、酶解溫度（X2）、加酶量（X3）這3個因素的交互作用對DPPH自由基清除率（Y）的影響。由圖可知，響應(yīng)值隨著酶解時間、酶解溫度、加酶量的增大而呈先增后降的趨勢。該響應(yīng)面能夠直觀地反映出各因素水平對響應(yīng)值的作用和影響。

圖5 時間與溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Response surface of time and temperature on DPPH radical scavenging rate

圖6 時間與加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Response surface of time and enzyme addition on DPPH radical scavenging rate

圖7 溫度與加酶量對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Response surface of temperature and enzyme additionon DPPH radical scavenging rate

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果驗證

對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行優(yōu)化分析，以DPPH自由基清除率最大為評價指標，由回歸方程得到的DPPH自由基清除率最高的組合為：X1=4.5，X2=45，X3=3.1，此時DPPH自由基清除率理論值81.60%。為驗證預(yù)測模型結(jié)果的可行性，在酶解時間為4.5 h，酶解溫度為45℃，加酶量為3.1%的條件下，進行中性蛋白酶酶解蝦夷扇貝的試驗，重復(fù)試驗3次，試驗結(jié)果的DPPH自由基清除率平均值為82.06%，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.56%。由此可以知道，預(yù)測模型與真實值之間有較好的擬合性，能較準確地反映中性蛋白酶酶解蝦夷扇貝過程中DPPH自由基清除率的變化。

2.5 蝦夷扇貝酶解液的抗氧化活性

對優(yōu)化條件下得到的蝦夷扇貝酶解液進行抗氧化活性測定，結(jié)果為：總抗氧化能力為0.11 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為0.37 U/g prot，羥自由基清除率為55.31%。

3 結(jié)論

本研究對蝦夷扇貝進行生物蛋白酶酶解，以扇貝蛋白水解度和酶解液DPPH自由基清除率為指標進行了酶解作用單因素試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面的方法優(yōu)化了酶解時間、酶解溫度、加酶量工藝參數(shù)對DPPH自由基清除率的影響。優(yōu)化后的酶解條件為：加酶量為3.1%，酶解溫度為45℃，酶解時間為4.5 h，此時測得酶解液DPPH自由基清除率為82.06%（與預(yù)測值的相對誤差為0.56%），?？偪寡趸芰?.11 U/mg prot，抗超氧陰離子活力為0.37 U/g prot，羥自由基清除率為55.31%。這說明蝦夷扇貝酶解液具有較高的抗氧化能力，為后期研發(fā)具有抗氧化活性的扇貝發(fā)酵調(diào)味品提供了理論依據(jù)。

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Optimization of Antioxidant Peptide Hydrolyzate of Patinopecten yessoensis by Response Surface Methodology

LIANG Xiao-fang1，MU Jian-lou1，*，YAN Chao1，SONG Chun-hua1，YIN Si-ya2，LIU Jian-da3
（1.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071000，Hebei，China；2.Product Quality Supervision and Inspection Institute of Baoding，Baoding 071000，Hebei，China；3.Agricultural Bureau of Dingzhou，Dingzhou 073000，Hebei，China）

2017-03-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.017

河北省科技計劃項目(14273205D)

梁曉芳（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學。

*通信作者：牟建樓（1973—），女（漢），副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。