郭丹丹，成樂琴，*，于金龍，李玲，甘鳳琴

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.通化百奧金森生物科技有限公司，吉林通化134000）

人參皂苷Rg5的提取制備工藝研究

郭丹丹1，成樂琴1，*，于金龍1，李玲2，甘鳳琴2

（1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林吉林132022；2.通化百奧金森生物科技有限公司，吉林通化134000）

在檸檬酸作用下，以人參須根粉為原料直接提取制備人參皂苷Rg5，以達到簡化試驗步驟、節(jié)省時間、綠色制備的目的。通過單因素試驗探索提取溫度、酸濃度和固液比對人參皂苷Rg5得率的影響，響應(yīng)曲面分析法對人參皂苷Rg5的提取制備工藝進行優(yōu)化，通過高效液相色譜法（HPLC）對人參皂苷Rg5進行定量分析。試驗結(jié)果表明，人參皂苷Rg5的加樣回收率為99.73%～101.72%，平均加樣回收率為100.37%；人參皂苷Rg5以在溶液中48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；在檸檬酸的催化下，水-正丁醇=8∶2（體積比）的混合溶劑為提取劑，提取溫度為112℃，酸濃度為0.14 mol/L，固液比為1∶28（g/mL），人參皂苷Rg5得率為1.54%。

人參皂苷Rg5；檸檬酸；人參須根粉；提取

Abstract：To direct extraction of ginsenoside Rg5 from ginseng fibrous root powder，using citric acid as catalyst，ginseng fibrous root powder（GFRP）as raw material.The preparation process was optimized by response surface method basised on single factor experiment，the extraction temperature，acid concentration and solid to liquid ratio were investigated，and the rate of ginsenoside Rg5 was analyzed by HPLC.The results showed that the recovery rate was 99.73%-101.72%and the average recovery rate was 100.37%；ginsenoside Rg5 had good stability within 48 h in solution；and when the volume rate of water：n-butanol was 8∶2，the extraction temperature was 112℃，the acid concentration was 0.14 mol/L，the solid-liquid ratio was 1∶28（g/mL），the extraction rate of ginsenoside Rg5 could reach 1.54%.

Key words：ginsenoside Rg5；citric acid；ginseng fibrous root powder；extraction

人參皂苷Rg5是紅參中含有的微量稀有人參皂苷[1]，可由原人參二醇組皂苷（protopanaxdiol ginsenoside，PPD）在C-20位選擇性水解生成的人參皂苷Rg3基礎(chǔ)上，進一步在C-20位的-OH與C-22位的-H脫水而成，在保護神經(jīng)[2-4]、抗腫瘤[5-6]、改善記憶[7-8]、改善肺部炎癥[9-10]等方面具有顯著效果。人參須根粉中人參皂苷Rg5轉(zhuǎn)化途徑見圖1。

由圖1可知，人參皂苷Rg5在制備過程中根據(jù)水解和脫水方式不同，常常伴隨Rd、F2、Gypenoside XVII、Rh2、Rk1和Rz1等其他次級人參皂苷的產(chǎn)生，因此制備產(chǎn)率低，關(guān)于其制備研究報道非常少[11-15]。目前人參皂苷Rg5的制備途徑主要包括“先提取人參皂苷、后轉(zhuǎn)化制備人參皂苷Rg5”和“先制備含有人參皂苷Rg5的人參產(chǎn)品、后提取人參皂苷”兩種方法。人參皂苷Rg5的制備無論采用哪種方法，一方面制備所需時間長，少則需要幾十個小時，多則上百個小時；另一方面提取工藝較長，提取效率（或得率）較低，因此有必要開發(fā)一種簡單易行、高效制備人參皂苷Rg5的方法。

圖1 人參須根粉中人參皂苷Rg5轉(zhuǎn)化途徑Fig.1 Conversion pathway of ginsenoside Rg5 in GFRP

本文研究了檸檬酸條件下直接提取制備稀有人參皂苷Rg5的方法，并以人參皂苷Rg5得率為考察指標進行了工藝優(yōu)化，以達到提高提取效率，簡化試驗步驟，節(jié)省時間的目的。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

GFRP：吉林省通化彩森仁生物有限公司提供；對照品人參皂苷Rg5（批號MUST-15051917，純度≥98%）、20（S）-Rg3（批號 MUST-12041211，純度≥98%）、20（R）-Rg3（批號 MUST-12080811，純度≥98%）：成都曼斯特公司；乙腈（色譜純）：瑞典歐森巴克化學公司；甲醇（色譜純）、正丁醇等溶劑（國產(chǎn)分析純）：天津大茂化學試劑廠。

高效液相色譜儀（配有P230P高壓恒流泵；UV230+紫外-可見檢測器；EC-2000 LU工作站）：大連依利特分析儀器有限公司；反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱月旭材料科技（上海）有限公司；H2050R型高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HJ-6A多頭磁力攪拌器：金壇市科析儀器有限公司；UPH-IV-40型優(yōu)普超純水發(fā)生器：成都超純科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取干燥的人參皂苷 Rg5、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3對照品適量，用色譜純甲醇定容至10 mL，配制成對照品貯備液（含人參皂苷Rg5 264.767 μg/mL、20（S）-Rg3 495.2 μg/mL、20（R）-Rg3 524.4 μg/mL），移取不同體積的對照品貯備液加甲醇定容至10 mL，配制成不同質(zhì)量濃度的對照品貯備液，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進行定量分析繪制標準曲線。

1.2.2 樣品溶液的制備

稱取1 g人參須根粉于平底燒瓶中，分別加入適量檸檬酸固體、蒸餾水和正丁醇于90℃加熱回流4 h。提取劑冷卻至室溫，用飽和碳酸鈉溶液中和至pH值6～7。將中和后的提取物轉(zhuǎn)移到離心機中離心，取上清液于圓底燒瓶中，固體加入10 mL水飽和正丁醇萃取3次，合并有機相，于50℃濃縮至干。殘留物加40 mL色譜純甲醇超聲溶解，0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC定量分析，計算人參皂苷Rg5得率。

1.2.3 色譜條件

[16]分析方法，樣品的色譜條件如下：檢測波長為 203 nm，進樣量20 μL，柱溫 35℃，流速1 mL/min。流動相為乙腈（A）～水（B）。梯度：0～10 min，10 min～20 min，20 min～25 min，25 min～45 min，45 min～60 min，60 min～65 min，65 min～75 min，75 min～82 min，82min～82.10min，82.10min～100min，100min～100.10min，100.10 min～115 min；22%A，22%A～27%A，27%A～31%A，31%A～38%A，38%A～52%A，52%A，52%A～55%A，55%A～60%A，60%A～90%A，90%A，90%A～22%A，22%A。

1.2.4 人參皂苷Rg5得率計算

式中：Y為得率，%；X為樣品中Rg5的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素考察

稱取人參須根粉1 g于150 mL平底燒瓶內(nèi)，按照“1.2.3”項操作，以預(yù)設(shè)的酸濃度（0.08 mol/L～0.24 mol/L）、提取溫度（80℃～120℃）、固液比[1∶15（g/mL）～1∶55（g/mL）]進行人參皂苷Rg5的提取，考察不同因素對人參皂苷Rg5得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、酸濃度（B）和固液比（C）為考察因素，各因素選取3個水平，以人參皂苷Rg5得率為考察目標，運用Design-Expert.V8.0.6軟件，優(yōu)化檸檬酸催化人參須根粉中人參皂苷Rg5的提取制備工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

取“1.2.1”中配制的不同濃度的混合對照品貯備液，在“1.2.3”色譜條件下進行定量分析，記錄峰面積。得到人參皂苷Rg5的回歸方程及線性范圍如下：YRg5=14.185X+40.192 （7.925 μg/mL～264.767 μg/mL,r=0.999 9），YS-Rg3=6.501 3X+16.078 （2.476 μg/mL～495.2 μg/mL，r=0.999 7）；YR-g3=4.761 6X+12.252（2.622 μg/mL～524.4 μg/mL，r=0.999 7）；在各自線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.2 加樣回收率試驗

準確稱取已知含量的樣品9份，按照“1.2.2”項下條件進行提取并定容。從中各取4 mL溶液于10 mL容量瓶中，精確加入樣品中人參皂苷Rg5含量的85%、100%、120%的對照品，加入色譜純甲醇定容，在“1.2.3”色譜條件下進樣，記錄峰面積，計算回收率在99.73%～101.72%，平均回收率為100.37%，RSD為1.51%（n=9），說明該方法的準確度較高。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取同一對照品溶液，在48 h內(nèi)，每隔6小時，在“1.2.3”色譜條件下進樣一次，測得人參皂苷Rg5峰面積的RSD為0.79%，峰面積無明顯變化，說明人參皂苷Rg5樣品溶液在48 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4 精密度試驗

取同一對照品溶液，在“1.2.3”色譜條件下重復進樣5次，測得人參皂苷Rg5峰面積的RSD為1.29%（n=5），說明儀器精密度良好。

2.5 單因素試驗結(jié)果分析

2.5.1 提取溫度對制備人參皂苷Rg5的影響

固定提取劑酸濃度為0.12 mol/L，固液比為1∶25（g/mL），只改變提取溫度在 80、90、100、110、120℃，按照“1.2.2”項條件提取制備人參皂苷Rg5并在“1.2.3”項色譜條件下進行定量分析，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對人參皂苷Rg5得率的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of ginsenoside Rg5

圖2結(jié)果表明，隨著提取溫度的增加，人參皂苷Rg5得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這是由于升高溫讀可以增大二醇組皂苷（PPD皂苷）的溶解度，從而使得Rg5得率增大，但當溫度過高，PPD皂苷的溶解度達到最大值，此時會導致Rg5進步分解從而降低Rg5得率。因此，提取溫度以110℃為宜，并選擇100℃～120℃作進一步優(yōu)化。

2.5.2 酸濃度對制備人參皂苷Rg5的影響

固定提取溫度 110℃，固液比為 1∶25（g/mL），只改變提取劑酸濃度為 0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mol/L，按照“1.2.2”項條件提取制備人參皂苷Rg5并在“1.2.3”項色譜條件下進行定量分析，結(jié)果見圖3。

圖3 酸濃度對人參皂苷Rg5得率的影響Fig.3 Effect of acid concentration on the yield of ginsenoside Rg5

隨著酸濃度的增加，人參皂苷Rg5得率先增加后減小，分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是在酸濃度較低時，原料中的PPD皂苷逐步轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg5，此時，以生成人參皂苷Rg5為主，當酸濃度大于0.16 mol/L時，原料中的大部分PPD皂苷已轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg5，而在同等酸性條件下，人參皂苷Rg5也會發(fā)生水解，此時，以人參皂苷Rg5的分解為主，從而降低人參皂苷Rg5得率。圖3表明，提取劑酸濃度為0.16 mol/L時Rg5得率最高，以0.12 mol/L～0.20 mol/L為進一步優(yōu)化條件。

2.5.3 固液比對制備人參皂苷Rg5的影響

固定提取溫度110℃，提取劑酸濃度0.16 mol/L，只改變固液比為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55（g/mL），按照“1.2.2”項條件提取制備人參皂苷Rg5并在“1.2.3”項色譜條件下進行定量分析。結(jié)果見圖4。

圖4 固液比對人參皂苷Rg5得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on yield of ginsenoside Rg5

由圖4可知，隨著固液比的增加，人參皂苷Rg5的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于人參須根粉中含有淀粉類物質(zhì)，當增大提取劑用量時，溶于提取劑中淀粉類物質(zhì)會附著于提取劑中的人參皂苷表面，從而導致人參皂苷Rg3和Rg5的得率下降。當固液比為1∶25（g/mL）時，人參皂苷Rg5得率最佳。并選擇 1∶15（g/mL）～1∶35（g/mL）進行進一步的優(yōu)化。

2.6 響應(yīng)曲面法優(yōu)化檸檬酸催化制備人參皂苷Rg5的工藝

2.6.1 分析因素及水平的選擇

根據(jù)對人參皂苷Rg5得率影響的顯著程度及Box-Behnken design試驗設(shè)計原理，選取提取溫度A、酸濃度B和固液比C三個因素，并采用三因素三水平的響應(yīng)曲面分析法。試驗因素及水平設(shè)計表見表1。

表1 響應(yīng)面因素及水平表Table 1 Response surface factors and levels

2.6.2 人參皂苷Rg5得率回歸模型的建立和顯著性檢驗

根據(jù)Box-Behnken design的中心組合試驗設(shè)計試驗方案，所得試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken design中心組合試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Design scheme and experimental results of Box-Behnken design

將表2的試驗數(shù)據(jù)利用ANOVA軟件進行擬合，得到關(guān)于人參皂苷得率Y與提取溫度等各因素之間的二階多項式方程：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 3，說明該方程的擬合度較高，而方程的決定性系數(shù)R2adj=0.982 4，說明該模型可以很好的描述98.24%的試驗結(jié)果，而Rpred=0.898 2，說明該模型可準確預(yù)測檸檬酸催化制備人參皂苷Rg5的結(jié)果?；貧w模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance Analysis of regression model

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance Analysis of regression model

2.6.3 檸檬酸催化提取制備人參皂苷Rg5的響應(yīng)曲面分析

為進一步研究提取溫度、酸濃度和固液比及各因素之間的相互作用對人參皂苷Rg5得率的影響，根據(jù)二階多項式方程做出響應(yīng)面，結(jié)果見圖5～圖6。

圖5 固液比和提取溫度及其相互作用對人參皂苷Rg5得率的響應(yīng)面分析及等高線圖Fig.5 Response surface analysis and contour map of the yield of ginsenoside Rg5 by the interaction between solid-liquid ratio and extraction temperature

圖5和圖6可直觀地看出固液比和提取溫度、固液比和酸濃度對人參皂苷Rg5得率影響較大，響應(yīng)面較陡，等高線密度較大。運用Design-Expert.V8.0.6軟件對人參皂苷Rg5的提取工藝進行優(yōu)化，預(yù)測人參皂苷Rg5的最佳提取工藝條件為：提取溫度112.08℃，提取液酸濃度 0.14 mol/L，固液比 1∶27.95（g/mL），人參皂苷Rg5的最佳得率為1.51%。

圖6 固液比和酸濃度及其相互作用對人參皂苷Rg5得率的響應(yīng)面分析及等高線圖Fig.6 Response surface analysis and contour map of the yield of ginsenoside Rg5 with the solid-liquid ratio and acid concentration and their interaction

為驗證響應(yīng)曲面法預(yù)測結(jié)果的可靠性，擬用試驗中所得的最佳提取工藝重復驗證試驗?？紤]到實際操作的便利，將最佳提取工藝條件進行修正，提取溫度112℃，提取液酸濃度 0.14mol/L，固液比為1∶28（g/mL）。按照修正后的提取條件重復3次試驗，得到人參皂苷Rg5的得率分別為1.52%、1.58%、1.55%，平均得率為1.54%，RSD值為1.78%，與理論值較為接近，因此，響應(yīng)曲面法預(yù)測的最佳提取工藝準確可靠，具有實用價值。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，在檸檬酸的作用下，人參須根粉中直接提取制備人參皂苷Rg5的最佳工藝條件為提取溫度112℃，提取液酸濃度0.14 mol/L，固液比為1∶28（g/mL），在此條件下，人參皂苷 Rg5得率為1.54%。

本論文通過采用常壓加熱回流的提取方式，融合了人參皂苷的提取及人參皂苷向人參皂苷Rg5的轉(zhuǎn)化，從人參須根粉中一步直接制備人參皂苷Rg5，彌補了傳統(tǒng)方法制備人參皂苷Rg5所存在的制備時間長、溫度高、制備效率低等缺點。

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Study on the Preparation Process of Ginsenoside Rg5

GUO Dan-dan1，CHENG Le-qin1，*，YU Jin-long1，LI Ling2，GAN Feng-qin2
（1.Department of Pharmacy and Applied Chemistry，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China；2.Tonghua Bai'aojinsen Biotechnology Co.，Ltd.，Tonghua 134000，Jilin，China）

2017-01-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.008

吉林省科技廳科技廳公關(guān)項目（20140306003YY）；吉林化工學院項目（吉化院合字[2015]第036號）

郭丹丹（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾及藥物合成。

*通信作者：成樂琴（1969—），女（漢），教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾及藥物合成。