趙文竹，王欣珂，于志鵬，*，張瑞雪，李思慧，劉靜波，勵建榮

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

響應(yīng)面優(yōu)化生姜多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

趙文竹1，王欣珂1，于志鵬1，*，張瑞雪1，李思慧1，劉靜波2，勵建榮1

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

采用Box-Benhnken法優(yōu)化生姜多糖的提取工藝參數(shù)，分別考察提取時間、提取溫度及液固比對多糖得率的影響，采用三因素三水平響應(yīng)面法進(jìn)行多糖提取工藝的優(yōu)化，利用傅立葉紅外光譜分析其結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，生姜多糖最佳提取時間為2 h 44 min，提取溫度為71.6℃，液固比為41∶1（mL/g），在此條件下，生姜多糖得率為3.13%。后經(jīng)抗氧化活性測定，生姜多糖提取物具有一定抗氧化活性。

生姜多糖；提??；純化；抗氧化活性

Abstract：The extraction of polysaccharides from ginger was optimizition by Bom-Benhnken desing，a multiple quadratic regression describing the relationship between the parameters such as extraction time，extraction temperature，liquid-to-material ratio were established using a 3-factor，3-lever Box-Behnkon design，and the structure of polysaccharides was analysised by FTIR.The results showed，the optimal extraction condition was obtained as extraction time 2 h 44 min ，extraction temperature71.6 ℃，liquid-to-material ratio 41∶1（mL/g）.Under such conditon the yield of polysaccharides from ginger was 3.13%.From some experimengts，we find ginger polysaccharides have antioxidant activity.

Key words：ginger polysaccharides；extraction；purificaiton；antioxidant activity

多糖類化合物具有多重生理功效，如抗氧化、驅(qū)寒、止嘔、健胃解毒、延緩衰老、降低膽固醇、抗癌、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗輻射等。龔濤等[1]研究了枸杞多糖的抗氧化和抗腫瘤功能，研究表明枸杞多糖能提高血清SOD酶的活力，Kodama等[2]研究了灰樹花多糖的抗腫瘤的作用，研究結(jié)果表明，多糖對抑制干擾素-γ、腫瘤致死因子-α的水平均有提高，該多糖對腫瘤細(xì)胞有抑制作用，Nair等[3]研究表明茜草中提取的一種多糖（RRl）具有免疫調(diào)節(jié)作用。

生姜，屬于姜科姜屬，多年生宿根草本植物，是最常用的香辛料之一。生姜中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如姜黃酮、姜辣素、姜糖蛋白、姜精油和姜多糖[4]，生姜多糖具有一定的抗氧化活性[5]，但生姜多糖的純化及紅外結(jié)構(gòu)研究相對較少。本研究以生姜為原材料，對生姜多糖提取工藝及其還原力活性進(jìn)行研究，同時對生姜多糖的紅外結(jié)構(gòu)進(jìn)行初探，旨在為生姜多糖活性的提取、純化及結(jié)構(gòu)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜：錦州市興隆大家庭超市；苯酚、抗壞血酸、鐵氰化鉀：天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司；濃硫酸：錦州古城化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氯化鐵：天津永晟精細(xì)化工有限公司；氯化亞鐵：天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸：天津市福晨化學(xué)試劑廠；以上藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5100紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市鑫鑫實驗儀器廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱：上?！憧茖W(xué)儀器有限公司；FA1204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；KF20002電子天平：浙江凱豐集團有限公司；TG16KR臺式高速冷凍離心機：長沙東旺實驗儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 熱水浸提法提取生姜多糖

將鮮生姜切片60℃烘干24 h，粉碎后過60目篩，制得生姜粉。準(zhǔn)確稱取一定量的生姜粉末樣品，放入圓底燒瓶中，加入適量的蒸餾水進(jìn)行熱水浸提，按照試驗設(shè)定的提取時間、提取溫度和液固比進(jìn)行熱水浸提，靜置冷卻至室溫，抽濾，得到生姜多糖提取液。

1.3.2 生姜多糖提取的單因素試驗

1.3.2.1 提取時間對生姜多糖得率的影響

取預(yù)處理的姜粉 2 g，以液固比為 30∶1（mL/g），水浴溫度為 70 ℃，提取時間分別為 1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，利用熱水浸提法進(jìn)行提取。測定多糖得率，比較選取最佳提取時間。

1.3.2.2 提取溫度對生姜多糖得率的影響

取預(yù)處理的姜粉 2 g，以液固比為 30∶1（mL/g），提取時間為 3 h，水浴溫度分別為 30、40、50、60、70、80、90℃，利用熱水浸提法進(jìn)行提取。測定多糖得率，比較選取最佳提取溫度。

1.3.2.3 液固比對生姜多糖得率的影響

取預(yù)處理的姜粉2 g，以水浴溫度為70℃，提取時間 3 h，液固比分別為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）利用熱水浸提法進(jìn)行提取。測定多糖得率，比較選取最佳液固比。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計及數(shù)據(jù)分析方法[7]

響應(yīng)面法以最經(jīng)濟的方式、較少的試驗次數(shù)和較短的時間對3種試驗因素進(jìn)行全面研究[6-7]。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，將影響生姜多糖得率（Y）的3個主要影響因素：提取時間（X1）、提取溫度（X2）、液固比（X3）進(jìn)行組合。以-1、0、1 代表自變量水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX對自變量進(jìn)行編碼。式中：xi為自變量的編碼值；Xi為自變量的真實值；X0為試驗中心點處自變量的真實值；ΔX為自變量的變化步長。試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 因素編碼表Table 1 Experiment factors coding table

根據(jù)因素和水平共安排設(shè)計17次試驗，試驗號1～12是析因試驗，試驗號13～17是中心試驗。17個試驗點分為析因和零點，其中析因點和零點分別為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點和區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。采用Design-Expert8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

1.3.4 生姜多糖含量的測定

多糖測定采用苯酚-硫酸法[8]。將生姜多糖提取液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)（N，稀釋倍數(shù)需要預(yù)試驗，使其在490 nm處測定吸光度值在0.2～0.8范圍內(nèi)）。依次吸取1 mL的樣品稀釋液、0.5 mL的苯酚、2.5 mL的濃硫酸依次加入試管中，沸水浴加熱15 min，靜置到室溫，在490 nm處測定其吸光度值（A490nm），由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程：y=（x+0.023）/0.01吸光度值為橫坐標(biāo)（x）、多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）為縱坐標(biāo)（y）。由回歸方程計算出以葡萄糖計的稀釋后生姜提取液中多糖的質(zhì)量濃度（y），計算出稀釋前生姜提取液中多糖的質(zhì)量濃度（C=y×N）

式中：Y為生姜多糖得率，%；C為生姜提取液中多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體體積，mL；W為原料質(zhì)量，g。

1.3.5 生姜多糖抗氧化活性研究

生姜多糖DPPH清除率的測定、還原力測定、金屬熬合能力測定的測定按照參考文獻(xiàn)[4]的活性測定完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取單因素試驗結(jié)果分析

不同因素對多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同因素對多糖得率的影響Fig.1 Effect of different factors on the yield of polysaccharides

由圖1（a）可以看出在2.5 h之前多糖得率明顯增加，說明隨著提取時間的增加，提取液中多糖濃度明顯增加。在2.5 h之后上下浮動，但總體平緩上升，3.5 h到達(dá)峰值后下降。說明在2.5 h到3.5 h期間大部分多糖包括果膠、黏液質(zhì)已溶出達(dá)到平衡，故多糖得率提高減慢，故不需要過長提取時間，因此提取時間選用2.5 h。由圖1（b）由圖可以看出隨溫度上升多糖得率逐漸增加，并在70℃達(dá)到峰值，70℃之后多糖得率趨于平緩并有所下降，說明溫度過高會使多糖降解，故多糖得率降低，故不需要過高提取溫度，因此提取溫度選用70℃。由圖1（c）可以看出液固比在40∶1（mL/g）之前多糖得率趨勢明顯增加，說明隨著液固比的增加，提取液中多糖濃度明顯呈增加的趨勢。在40∶1（mL/g）之后得率下降。說明水對多糖有一定的溶解度，一定量的水只能溶解一定的糖，但水分太大在一定加熱時間里，溫度升高速度減慢，多糖未充分溶于水中。故不需要過大液固比，因此液固比選用40∶1（mL/g）。綜上所述，最優(yōu)條件為提取時間2.5 h、提取溫度70℃、液固比 40∶1（mL/g）。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 試驗設(shè)計

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析表見表3。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of optimizing test by response surface method

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis

生姜多糖得率結(jié)果見表2，采用SAS RSREG程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析[6]，3個因素經(jīng)過擬合得到多糖得率（Y）回歸方程：

由表3可知，模型的P值小于0.05，表明二次方程擬合顯著，而且失擬項的P值大于0.05，表明失擬項不顯著，說明該模擬方程可行性較好，這種試驗方法是可靠的，即使用該方程模擬真實的三因素三水平分析是可行的。其中決定系數(shù)R2值為0.88，校正系數(shù)R2Adj值為0.73，則說明通過二次回歸得到的多糖得率的模型與試驗擬合較好。又因其變異系數(shù)CV值越低，顯示試驗穩(wěn)定性越好。由表3中SAS RSREG回歸分析可知，方程中X1對Y值影響極顯著，表明提取時間對多糖得率影響較大，X1X1，X2X2，X3X3對Y值影響均顯著，表明試驗因子對響應(yīng)值不是簡單地線性關(guān)系。綜上所述，該回歸方程為優(yōu)化熱水浸提生姜多糖的工藝條件提供了一個良好的模型，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

對于生姜多糖得率模型，回歸方程的方差分析結(jié)果表明，方程中的3個因素的線性平方和項的影響為顯著（P＜0.05）（表3）。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內(nèi)，3個因素對多糖得率影響的排序為提取時間（X1）＞提取溫度（X2）＞液料比（X3）。

2.2.2 影響生姜多糖得率的主要因素分析[7]

將建立的回歸模型中的任一因素固定在最優(yōu)水平，得到另外2個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖2～圖3所示。

圖2 交互作用對生姜多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

由圖 2～圖 3 所示，圖 3（a）為 X1X2交互等高線，可以看出提取時間軸向等高線變化密集，而溫度軸向等高線變化相對稀疏，說明提取時間對生姜多糖得率的影響比時間大；由圖2（a）得率先隨X1的升高而上升，達(dá)到一定值后開始下降，可能與加熱時間過長易使多糖分解有關(guān)。如圖3（b）在X1X3交互等高線中，提取時間軸向等高線變化密集，而液固比軸向等高線變化相對稀疏，說明提取時間對響應(yīng)值峰值的影響比液固比大；由圖2（b）可以看出得率先隨X1的升高而上升，達(dá)到一定值后開始下降，可能與加熱時間過長易使多糖分解有關(guān)。如圖3（c）在X2與X3交互作用等高線中，等高線密度在2個方向相差不大，沿X2軸方向略大于X3軸方向，說明提取溫度和液固比的交互作用中，提取溫度對響應(yīng)值峰值的影響略大于液固比。

用“規(guī)劃求解”對方程進(jìn)行求解，得最佳條件為：提取時間2 h 44 min、提取溫度71.60℃、液固比41∶1（mL/g），最佳生姜得率為3.10%。

圖3 交互作用對多糖得率影響的等高線圖Fig.3 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

2.3 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面法得出的最優(yōu)工藝參數(shù)，即提取時間2 h 44 min、提取溫度 71.60 ℃、液料比 41∶1（mL/g）的工藝條件提取生姜多糖。測定生姜多糖得率，以驗證響應(yīng)面法的可行性。試驗結(jié)果顯示多糖得率的實測值3.13%，預(yù)測值3.10%。預(yù)測值與實測值非常接近，偏差較小，說明由響應(yīng)面法所得到的優(yōu)化區(qū)域符合設(shè)計目標(biāo)，試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)模型具有可靠性和重現(xiàn)性。可見采用響應(yīng)面法可實現(xiàn)優(yōu)化生姜的提取工藝的目標(biāo)，得到具有實際應(yīng)用價值的多糖提取工藝流程。

2.4 抗氧化活性研究

分別測定生姜多糖對DPPH自由基的清除率、還原力和Fe2+的清除率如圖4所示。

圖4 生姜多糖的抗氧化活性Fig.4 The antioxidant activity of polysaccharides from ginger

多糖的還原力和清除率都呈明顯的上升趨勢，生姜多糖具有一定清除DPPH自由基的能力，而且隨著多糖濃度的增大而增高，維生素C和生姜多糖的IC50值分別為4.8 μg/mL和0.42 mg/mL，生姜多糖對DPPH自由基的清除能力相當(dāng)于維生素C的1.14%，生姜多糖具有一定的還原力，但還原力作用效果不大，相當(dāng)于維生素C的0.5%。生姜多糖具有一定清除Fe2+的能力，而且隨著多糖濃度的增大而增高，維生素C和生姜多糖的IC50值分別為4.21 μg/mL和2.18 mg/mL。

3 結(jié)論

通過Box-Benhnken的中心組合設(shè)計響應(yīng)面法建立了提取時間、提取溫度、液固比與多糖得率的數(shù)學(xué)模型，采響應(yīng)面優(yōu)化法實現(xiàn)了多糖提取的多指標(biāo)優(yōu)化，得出生姜多糖得率較高的最佳提取工藝參數(shù)為提取時間2 h 44 min、提取溫度71.6℃、液固比41∶1（mL/g），生姜多糖得率達(dá)到3.13%。生姜多糖DPPH自由基清除能力的IC50值為0.42 mg/mL，還原力相當(dāng)于維生素C的0.5%，金屬螯合能力的IC50值為4.18 mg/mL。

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Optimizition Extraction of Polysaccharides from Ginger by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity

ZHAO Wen-zhu1，WANG Xin-ke1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LI Si-hui1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-01-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.006

國家自然科學(xué)基金項目（31601479）；渤海大學(xué)博士啟動項目（0515bs020）

趙文竹（1986—），女（漢），講師，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鵬（1984—），男，講師，博士，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā)。