楊艷娟，楊桂蘭，鄭西衛(wèi)，張慧芳，程德云

·論 著·

FHL1和Paxillin在大鼠氣道黏液高分泌中的表達(dá)

楊艷娟1，楊桂蘭1，鄭西衛(wèi)1，張慧芳1，程德云2

目的探討FHL1和Paxillin在大鼠氣道黏液分泌中的作用。方法將20只雄性Wistar大鼠分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(內(nèi)毒素E組)。采用HE染色和阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色進(jìn)行氣道上皮杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)及檢測(cè)氣道黏液物質(zhì)表達(dá)。采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠黏液腺FHL1、Paxillin和MUC5AC蛋白的表達(dá)，對(duì)肺組織切片進(jìn)行圖像分析。結(jié)果內(nèi)毒素E組氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)、氣道MUC5AC、氣道及肺組織FHL1、Paxillin 和黏液物質(zhì)表達(dá)分別與正常對(duì)照組相比升高(P<0.05)。FHL1和Paxillin的表達(dá)與MUC5AC的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.962,0.868,P<0.05)。結(jié)論大鼠氣道和肺組織高表達(dá)FHL1 和Paxillin，可能參與了氣道黏液高分泌的發(fā)生。

四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白；樁蛋白；黏液高分泌

慢性氣道炎癥性疾病在呼吸系統(tǒng)疾病中有很高的發(fā)病率，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和支氣管哮喘，而此類慢性炎癥性疾病最重要的病理生理改變就是杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌旺盛，氣道內(nèi)積聚過多的黏液，使得本來已狹窄的氣道更加阻塞，而阻塞的氣道因口徑縮小促使氣道阻力成倍增加，肺功能下降速度更加明顯，同時(shí)潴留的氣道黏液是細(xì)菌天然的培養(yǎng)基，氣道內(nèi)感染反復(fù)出現(xiàn)，導(dǎo)致患者病情的急性加重和病死率的攀升[1]。因此研究氣道黏液高分泌的機(jī)制具有重要的臨床價(jià)值。既往的研究文獻(xiàn)[2-3]發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子參與了氣道黏液高分泌機(jī)制，筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)低氧性肺動(dòng)脈高壓肺小血管FHL1和Paxillin高表達(dá)[4-6]，但FHL1和Paxillin是否參與COPD氣道黏液高分泌的進(jìn)程文獻(xiàn)未見報(bào)道，為探討該因子在大鼠氣道黏液高分泌中的作用機(jī)制，本研究采用大鼠黏液高分泌模型復(fù)制的方法，分析該模型中黏液腺FHL1 和Paxillin的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 試劑：選用美國Sigma公司的內(nèi)毒素制造動(dòng)物模型、美國Neomarkers公司的黏蛋白5AC(MUC5AC)單克隆抗體、武漢博士德生物工程有限公司的FHL1兔抗人單克隆抗體和樁蛋白(Paxillin)小鼠抗人單克隆抗體以及SP試劑盒用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組：雄性Wistar大鼠20只(購于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量200～220 g。將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、實(shí)驗(yàn)組10只。正常對(duì)照組用空針抽取1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，充分麻醉成功后立即經(jīng)頸部切開皮膚，逐層將氣管清楚暴露在視野中，同時(shí)將100 μL生理鹽水注入氣管內(nèi)，然后直立大鼠并輕搖1～2 min。將濃度為2 g/L的LPS 100 uL注入實(shí)驗(yàn)組大鼠氣管腔內(nèi)。正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組置于同一實(shí)驗(yàn)室中，2組大鼠均自由飲水和攝食。

1.3 HE染色和AB-PAS染色：對(duì)第4天的內(nèi)毒素注射組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg，然后取大鼠左肺以10%中性甲醛固定3 d，取左肺沿肺門橫斷取材，石蠟包埋，切片厚道6～8μm，進(jìn)行HE常規(guī)染色，觀察氣道黏液腺形態(tài)學(xué)變化。進(jìn)行HE常規(guī)染色和阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色，進(jìn)行杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)觀察氣道黏液物質(zhì)的水平。用SPOT COOL CCD軟件采集圖像，用MAGEPRO plus 4.1軟件進(jìn)行灰度掃描分析。

1.4 肺組織免疫組化染色：肺組織標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定后，石蠟包埋切片，切片厚道6～8 μm，進(jìn)行免疫組化SP法染色。FHL1單克隆抗體和樁蛋白(Paxillin)單克隆抗體的最佳測(cè)試濃度是1∶100和1∶150。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陽性染色結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。對(duì)免疫組化染色片進(jìn)行灰度掃描，觀察正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠氣道黏液腺FHL1、Paxillin和MUC5AC表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組間比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用皮爾遜法。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞積分和黏液物質(zhì)的表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組(內(nèi)毒素E組)大鼠無論是杯狀細(xì)胞積分還是黏液物質(zhì)的表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P<0.05)，見表1。

表1 2組大鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞積分和黏液物質(zhì)的表達(dá)

2.2 正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠氣道及肺組織病理學(xué)改變：正常對(duì)照組大鼠氣管腔寬敞，管壁組織較薄，管腔周圍組織無明顯炎癥病變，亦未見杯狀細(xì)胞存在于管腔內(nèi)，見圖1(目錄后)。而實(shí)驗(yàn)組大鼠氣管腔狹窄明顯，管壁組織明顯增厚，管腔周圍組織可見炎癥細(xì)胞浸潤明顯，同時(shí)管腔內(nèi)出現(xiàn)大量杯狀細(xì)胞，增生的杯狀細(xì)胞分泌大量的黏液充斥在管腔內(nèi)，有時(shí)可見管腔內(nèi)黏液栓形成，見圖2(目錄后)。

2.3 正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠氣道FHL1和Paxillin的表達(dá)水平：運(yùn)用免疫組化染色法，圖3(目錄后)顯示正常對(duì)照組大鼠FHL1表達(dá)很弱，而圖4(目錄后)顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠FHL1表達(dá)明顯增強(qiáng)，經(jīng)MAGEPRO plus 4.1軟件分析圖像顯示，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組FHL1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣，實(shí)驗(yàn)組Paxillin和MUC5AC的表達(dá)也較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見圖5-圖6(目錄后)，F(xiàn)HL1、Paxillin和MUC5AC表達(dá)水平見表2。

表2 2組大鼠FHL1和Paxillin水平變化

2.4 FHL1和Paxillin表達(dá)與MUC5AC相關(guān)性：運(yùn)用皮爾遜法發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道黏液腺FHL1表達(dá)與MUC5AC呈正相關(guān)(r=0.962，P<0.05)；Paxillin表達(dá)與MUC5AC表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.868，P<0.05)。

3 討論

氣道慢性炎癥性疾病是呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)，它受各種復(fù)雜因素調(diào)節(jié)和制約，可能通過相同或不同的調(diào)節(jié)通路調(diào)節(jié)氣道黏液分泌過程。黏液高分泌的病理學(xué)基礎(chǔ)是杯狀細(xì)胞的化生和黏液腺體的肥大增生，小氣道因?yàn)槠涮厥獾慕馄式Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要靠杯狀細(xì)胞的化生，而非黏液腺體的增生。因此作為公認(rèn)的杯狀細(xì)胞標(biāo)志的MUC5AC可體現(xiàn)杯狀細(xì)胞分泌狀態(tài)。MUC5AC受多種因素的調(diào)節(jié)，如通過感染、免疫炎癥反應(yīng)介質(zhì)、內(nèi)外環(huán)境化合物在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，也可通過蛋白酶在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[2-3]。

FHL1屬于FHL(four and half LIM domain)家族，目前發(fā)現(xiàn)FHL家族有5個(gè)成員，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT(activator of CREM in testis)。該家族蛋白結(jié)構(gòu)中含有四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域，屬于LIM超家族。LIM是3種轉(zhuǎn)錄因子Lin-11、Lsl-1和Mec3的縮寫，LIM結(jié)構(gòu)域由約55個(gè)氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸，形成2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其保守的半胱氨酸和組氨酸殘基形成具有Zn2+結(jié)合的穩(wěn)定三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，是介導(dǎo)與其他蛋白質(zhì)相互左右的主要區(qū)域[8]。樁蛋白是一種主要定位于黏著斑的信號(hào)蛋白，包含LD模體、LIM結(jié)構(gòu)域等多種結(jié)構(gòu)域。作為一種多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，樁蛋白可與多種結(jié)構(gòu)蛋白和信號(hào)蛋白結(jié)合，不僅可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和黏附分子，參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、驅(qū)化[9]，還在很多病理方面起很重要的作用，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及腫瘤轉(zhuǎn)移和遷移等[10-11]。

Christine Veith[12]采用免疫熒光染色、免疫組化技術(shù)和Western Blot等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Paxillin或FHL1在人PASMC與肌動(dòng)蛋白微絲有關(guān)，提示纖維連接素增加細(xì)胞黏附和促進(jìn)Paxillin定植在局部黏附復(fù)合體。用siRNA敲除的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PASMC和纖維連接素的連接依賴于Paxillin和FHL1的共同作用。去除Paxillin顯示出肌動(dòng)蛋白骨架的不完整性從而影響細(xì)胞黏附。這些結(jié)果顯示纖維連接素、Paxillin和FHL1相互影響，對(duì)于ECM和細(xì)胞骨架蛋白的細(xì)胞黏附功能來說至關(guān)重要。該實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Paxillin和FHL1相互作用，在肺動(dòng)脈高壓患者肺組織中兩者均升高，而且其表達(dá)依賴于HIF-1α。肺動(dòng)脈平滑的細(xì)胞這些均表明Paxillin和FHL1參與了肺動(dòng)脈高壓肺血管的重建。另有文獻(xiàn)顯示，低氧誘導(dǎo)/PDGE-BB-依賴的樁蛋白Paxillin激酶磷酸化可以被HIF-1α或imatinib治療后的消耗所逆轉(zhuǎn)。同時(shí)Li Y的研究發(fā)現(xiàn)FHL1在香煙誘導(dǎo)(CSE)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中起很大作用，用基因敲除FHL1表達(dá)的siRNA在細(xì)胞基礎(chǔ)水平和CSE刺激下可以通過細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶途徑顯著抑制細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞周期G1和S期的轉(zhuǎn)錄。CSE隨著FHL1表達(dá)的增加明顯增加，但在mRNA水平無變化。這種改變可能與延長FHL1的半衰期有關(guān)，導(dǎo)致蛋白降解的中和作用。相反，用腺病毒增加細(xì)胞增生和激發(fā)細(xì)胞周期G1和S期的轉(zhuǎn)錄同樣可引起過度表達(dá)的FHL1。Paxillin 促進(jìn)腫瘤血管生成、血管轉(zhuǎn)移和侵襲，主要與其細(xì)胞黏附、遷移有關(guān)。既往文獻(xiàn)對(duì)FHL1和Paxillin的研究主要集中在肺動(dòng)脈高壓、肺血管重建及骨骼肌方面，且多數(shù)與HIF-1α有關(guān)。筆者先前的研究也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)論，即FHL1和Paxillin在低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織和肺動(dòng)脈平滑肌中高表達(dá)[4-6]，而本次研究發(fā)現(xiàn)FHL1與Paxillin表達(dá)不僅與肺動(dòng)脈高壓肺血管重建有關(guān)，與氣道炎癥及杯狀細(xì)胞分泌亦有關(guān)，在內(nèi)毒素E組大鼠氣道炎癥比較明顯的腺體組織內(nèi)FHL1和Paxillin明顯表達(dá)，而且其表達(dá)與MUC5AC的表達(dá)呈正相關(guān)，我們推測(cè)FHL1和Paxillin作為細(xì)胞骨架蛋白分子，可促進(jìn)氣道內(nèi)黏液腺的增生和分泌，但其機(jī)制如何、FHL1和Paxillin是通過何種細(xì)胞信號(hào)通路參與杯狀細(xì)胞黏液腺增生、與HIF-1α關(guān)系如何均需通過后續(xù)的試驗(yàn)研究來加以證實(shí)。

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TheexpressionofFHL1andPaxillininratswithairwaymucushypersecretion

YANGYanjuan1,YANGGuilan1,ZHENGXiwei1,ZHANGHuifang1,CHENGDeyun2.

1.DepartmentofRespiratory,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.DepartmentofRespiratory,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China

AbstractObjectiveTo explore the expression of FHL1 and Paxillin in rats mucous hypersecretion.MethodsTwenty males Wistar rats were divided into two groups:the endotoxin group and control group respectively.The count of epithelial goblet cell,the expression of mucin in bronchial tissues were examined by HE and Alcain Blue-Periodic and Schiff (AB-PAS) stained respectively.The expression of FHL1,Paxillin and MUC5AC in the lungs of rats were measured by immunohistochemical.The histological sections of the lungs were examined by image analysis.ResultsCompared with the control group,the count of epithelial goblet cell,the expression of FHL1,Paxillin and MUC5AC protein were increased in endotoin group (P<0.05).The expression of FHL1 and Paxillin were positively correlated with the expression of MUC5AC (r=0.962,0.868,P<0.05).ConclusionThe high expression of FHL1 and Paxillin may play an important role in the pathogenesis process of the airway mucous gland of hypersecretion.

FHL1;Paxillin;MucousHypersecretion

10.13621/j.1001-5949.2017.09.0769

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ1202)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科,寧夏 銀川 750004 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科,四川 成都 610041

楊艷娟(1973-)，女，主任醫(yī)師，博士學(xué)位，主要從事肺動(dòng)脈高壓研究。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170926.1023.002.html

R56

A

2017-03-05責(zé)任編輯李 潔